利用轉座標簽mTn-lacZ/leu2插入突變發酵性絲孢酵母2.1368-Leu?篩選高效產油突變株

宋安東，劉玉博，謝慧，王風芹，鮑曉明

1 河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002

2 山東大學微生物技術國家重點實驗室，濟南 250100

利用轉座標簽mTn-lacZ/leu2插入突變發酵性絲孢酵母2.1368-Leu?篩選高效產油突變株

宋安東1*，劉玉博1*，謝慧1，王風芹1，鮑曉明2

1 河南農業大學生命科學學院，鄭州 450002

2 山東大學微生物技術國家重點實驗室，濟南 250100

為提高微生物油脂產率，降低其生產成本，以轉座標簽 mTn-lacZ/leu2插入突變發酵性絲孢酵母 2.1368-Leu?篩選高效產油突變株。利用LacZ顯色反應、脂肪酸合成酶抑制劑Cerulenin和磷酸香草醛反應，最終在玉米秸稈糖化液中篩選出一株高效產油突變株2.1368-Leu?-7。結果表明其油脂含量為38.30%，比對照的29.33%高了8.97%，而其產油率為8.35%，比對照的6.92%提高了20.63%；在玉米秸稈糖化液中的糖利用率為77%，每100 g玉米秸稈可轉化油脂8.32 g。可為未來生物柴油產業提供了廉價原料。

轉座標簽，磷酸香草醛反應，玉米秸稈糖化液，生物柴油

Abstract:To improve microbial lipid production, we inserted mTn-lacZ/leu2 into Trichosporon fermentans 2.1368-Leu?to obtain high lipid production mutants. By observing the LacZ chromogenic change, the positive reaction between Cerulenin (inhibitor of fatty acid synthase) and phosphate vanillin, a higher lipid-producing mutant 2.1368-Leu?-7 grown on corn-stalk hydrolysate was obtained. The lipid content of this mutant reached 38.30% (8.97% higher than that of the control) and the lipid production rate was 8.35% (20.63% higher than that of the control). The rate of sugar utilization was 77%, meaning that 100 g corn-stalk could be converted to 8.32 g lipid. The study provided an effective method for microbial lipid production by using cheap raw materials for biodiesel.

Keywords:Trichosporon fermentans, transposon tagging, corn stalk, biodiesel

生物柴油是典型的“綠色能源”，大力發展生物柴油對發展低碳經濟、推進能源替代和減輕環境壓力具有重要的戰略意義[1-2]。當前利用動植物油脂生產生物柴油，原料成本偏高，并且穩定、充足的油脂原料供應體系尚未形成。而微生物油脂發酵周期短，不受場地、季節、氣候變化等因素的影響；且產油微生物菌種資源豐富，能利用和轉化各種農林廢棄木質纖維素原材料，對農業大國具有特殊的意義。因此，利用微生物轉化法獲取油脂具有非常大的發展潛力[3-4]。

轉座子標簽技術是根據轉座子隨機插入突變的特性而發展起來的研究基因功能的新方法。山東大學微生物技術國家重點實驗室利用 mTn3轉座標簽對釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae W303.1A進行誘變、篩選得到突變體263-H9，該突變體表現出對多種逆境脅迫敏感的表型特征，并最終確定了263-H9突變體的鹽敏感相關基因[5]。轉座子標簽技術主要用于植物基因組和功能序列的分離與研究。任爭光等[6]利用轉座子 Mini-Tn5構建致病菌株MH21的突變體庫，篩選得到 1株致病性完全喪失的突變體M543。對M543中轉座子插入基因的克隆和測序表明其突變基因為燕麥食酸菌Ⅲ型分泌系統(TTSS) 中的保守基因hrcR[6]。

發酵性絲孢酵母 Trichosporon fermentans 2.1368，酵母目隱球酵母科毛孢酵母屬，屬于茁芽毛孢酵母的一種，是可以進行全糖發酵的產油酵母，具有易培養、木糖轉化率高等特點。近幾年，對發酵性絲孢酵母2.1368的研究主要集中在發酵條件的優化，而對此菌株的改造尚未見報道。用濃度為 1.0 mg/mL的亞硝基胍，處理 1.0 h，誘變2.1368，得到2.1368的亮氨酸缺陷型2.1368-Leu?。本研究以2.1368的亮氨酸缺陷型2.1368-Leu?為出發菌株，采用轉座標簽 mTn-lacZ/leu2插入突變的方法，篩選出一株在玉米秸稈糖化液發酵中產油率明顯提高的突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

菌種：發酵性絲孢酵母Trichosporon fermentans 2.1368，購于中國工業微生物菌種保藏中心；發酵性絲孢酵母Trichosporon fermentans 2.1368的亮氨酸營養缺陷型2.1368-Leu?，本實驗室篩選；大腸桿菌DH5α，河南農業大學微生物學系保藏菌種。

質粒：mTn3轉座子標簽系列的 mTn-lacZ/leu2轉座標簽插入文庫質粒15個，編號分別為P21-P29、P31、P34-P38，山東大學鮑曉明教授贈送。mTn-lacZ/leu2轉座子標簽插入示意圖如圖1所示。

圖1 mTn-lacZ/leu2轉座子標簽插入文庫Fig. 1 Pools of the yeast genomic library with mTn-lacZ/leu2 transposon tagging.

轉座子標簽插入文庫是以 mTn3轉座標簽對構建于載體 pHSS6上的釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae染色體文庫進行隨機插入而得。它具有38 bp的末端重復序列、res位點與lox位點，并加入了 Amp抗性標記、Leu缺陷型標記和沒有啟動子的報道基因LacZ，以及2個相同的Not ?酶切位點[7]。

1.1.2 試劑與溶液

2.24×103mol/L Cerulenin (淺藍菌素) 母液：5 mg Cerulenin充分溶解于10 mL DMSO (二甲基亞砜) 中。

磷酸香草醛試劑：0.12 g香草醛溶解于20 mL蒸餾水中，用85%的磷酸定容至100 mL。

1.1.3 培養基

發酵性絲孢酵母2.1368菌種活化培養基 (麥芽汁培養基)：糖度為12-13波美度的麥芽汁，2%瓊脂。

2.1368營養缺陷型篩選基本培養基 (SD)[8](g/100 mL)：酵母氮源 (不含氨基酸) 0.67，葡萄糖2，瓊脂2，硫酸銨 0.5，pH 6.0，(或加腺嘌呤80 mg/L)。

YAPD培養基 (g/100 mL)：酵母浸膏1，蛋白胨2，葡萄糖2，腺嘌呤80 mg/L，瓊脂2 (YAPD培養基加腺嘌呤可抑制ade1和ade2突變株的回復突變)。

X-gal顯色平板培養基(g/100 mL)：0.6 mL X-gal貯存液，Na2HPO43.5814，硫酸鎂0.0245，瓊脂1.6，pH 7.0。

發酵性絲孢酵母2.1368產脂培養基 (g/100 mL)：葡萄糖12，酵母膏0.8，蛋白胨0.3，KH2PO40.7，MgSO4·7H2O 0.1，乙醇 0.2，pH 5.8。

玉米秸稈糖化液發酵培養基：用體積分數為1%的稀H2SO4于121 ℃預處理60 min后，加入蒸餾水調節 pH值至 5.0，使固液比達到 10∶1，然后加入纖維素酶25 g/kg和木聚糖酶液20 mL/kg，120 r/min、50 ℃處理48 h，過濾除渣得糖化液。糖化液中總還原糖濃度為 5.2%，其中葡萄糖濃度為3.9%，木糖為1.2%，其余為雜糖。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉座標簽文庫質粒插入片段的獲得

將15個mTn-lacZ/leu2轉座標簽插入文庫質粒分別轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落提取質粒，將質粒用Not I酶切，并回收轉座子標簽文庫質粒的插入片段 (8 kb左右)。

1.2.2 酵母的高效轉化方法[9]

將菌種 2.1368-Leu?用 100 mmol/L醋酸鋰(LiAc) 處理并懸浮細胞，每 100 μL等份分裝到1.5 mL EP管，離心后除去LiAc。按如下量加入轉化混合液：PEG 3350 (50%，W/V)，240 μL；1.0 mol/L LiAc，36 μL；單鏈載體 DNA (2.0 mg/mL)，25 μL；水和質粒DNA，50 μL；劇烈振蕩后置28 ℃保溫30 min轉化酵母，然后于42 ℃水浴中熱激25 min。10 000 r/min高速離心30 s除去轉化混合液后，吸0.4 mL無菌水加到每個EP管中，懸浮沉淀，用等份的200 μL轉化混合液涂布選擇平板SD，28 ℃培養3 d左右。

本試驗用 P26號質粒酶切回收片段為例研究2.1368-Leu?的最佳轉化熱激時間，設計10、15、20、25、30、35、40 min為熱激時間梯度。

1.2.3 同源重組質粒的篩選

挑取 SD平板上生長出來的轉化子落涂片于YAPD平板上，每板的密度為100個鋪片，28 ℃條件下培養24 h，用一張無菌濾紙將該平板復制于另一加有腺嘌呤的 SD平板上，28 ℃過夜。將濾紙取出，克隆面向上，置于一密閉容器中，容器底部加入10 mL氯仿處理10~30 min，取出濾紙，再將其克隆面向上置于X-gal平板 (120 μg/mL X-gal，0.1 mol/L Na2PO4和1 mmol/L MgSO41.6% 瓊脂糖)上，28 ℃條件下顯色1 d。

1.2.4 淺藍菌素Cerulenin初篩高產油脂酵母

確定2.1368原始菌株對Cerulenin的最小抑制濃度，即在每 10 mL 2.1368固體培養基中分別加入2.24×10?3mol/L的 cerulenin母液 0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL制成梯度培養基，按照常規方法涂布平板，統計cerulenin對菌體菌落形成率的影響。

1.2.5 磷酸香草醛反應篩選高產油脂突變株[10-11]

對初篩菌株進行產脂培養后，取10 mL菌液，4 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗1~2次。定容至2 mL，取100 μL (對照取蒸餾水) 加入一帶塞試管中，加入18 mol/L的H2SO42 mL，沸水浴中孵化10 min，常溫水浴5 min，加入5 mL磷酸香草醛試劑，37 ℃保溫15 min，常溫水浴10 min，于530 nm測其OD值。

1.2.6 生物量的測定

通過4 500 r/min離心l0 min，收集菌體并干燥(干燥溫度：80 ℃) 至衡重，準確稱取干菌體量。

1.2.7 發酵驗證試驗[12]

對所篩突變株在玉米秸稈糖化液中進行發酵試驗驗證。其中

干菌體含油率=粗油脂重量/干菌體重量×100%。產油率=粗油脂重量/加入糖化液糖質量×100%。

2 結果與分析

2.1 所提取的轉座標簽插入文庫質粒及其 NotⅠ酶切結果

將 15個轉座標簽插入文庫質粒轉化大腸桿菌DH5α、挑取陽性克隆提取質粒備用。純化后的質粒經NotⅠ酶切，相應質粒的酶切產物所得到的兩條帶。含有酵母同源序列和 mTn-lacZ/leu2轉座子的片段(6 654 bp) 不均一，約8~10 kb大小，而不含有酵母同源序列的載體pHSS6片段則大小一致，為2.1 kb。

2.2 發酵性絲孢酵母2.1368-Leu?的高效轉化

用回收后的DNA片段進行酵母高效轉化，確定最佳熱激時間為20 min，適宜的熱激時間范圍擴大至15~35 min。將15個轉座子標簽插入文庫質粒采用以上轉化條件 (即熱激時間為20 min或25 min)轉化2.1368-Leu?，在SD篩選平板上得到的轉化子情況如表1所示。

由表1可以看出，經過轉化試驗共得到166個轉化子，其中成功實現轉化的質粒為P22、P24、P25、P26、P27、P29、P31、P34、P35、P37、P38，用所得到的15個轉座子標簽文庫質粒進行酶切轉化，有4個沒有實現成功轉化。

表1 酵母高效轉化所得轉化子情況Table 1 Transformants gained by yeast efficient transformation

試驗中所用的轉座子的報道基因 LacZ沒有啟動子，缺失了前端的ATG序列，載體在Not I線性化之后重組片段自身就不攜帶啟動子，轉座子系統中，LacZ基因下游有—LEU基因，因此選用亮氨酸缺陷型的酵母菌株作為重組菌株，該菌株不能夠在缺少亮氨酸的 SD培養基上生長，只在含有上述轉座系統的質粒同源重組到酵母中，并且有啟動子在其上游啟動它轉錄，且能夠按三聯密碼子正確讀框，該重組酵母菌株才能夠編碼合成亮氨酸，從而在亮氨酸缺陷型的SD平板上生長。

2.3 同源重組質粒的篩選

利用LacZ顯色反應，根據其顯色水平，可以判斷LacZ基因前端的啟動子強弱。在含X-gal平板上對試驗中得到的 166個轉化子進行同源重組子篩選，結果如圖2所示。

從圖2中可以看出，P26-3和P26-5號不顯藍色(圖中實箭頭所指)，其他P26號質粒的轉化子藍色都較深，說明這兩個轉化子不是同源重組子，可能是閱讀框架錯誤，應該是試驗誤差；P35和 P25號質粒的轉化子藍色較弱，其中P25-5基本不顯藍色 (圖中方框處)，可能因為 LacZ基因上游的啟動子太弱，不能很好完成轉錄所致。因此，在用mTn-lacZ/leu2轉座標簽對發酵性絲孢酵母進行插入突變過程中，P22、P24、P26、P27、P29、P31、P34、P37 和 P38這9個質粒是比較適合的同源載體。篩選166個轉化子，最終得到 139個同源重組子，可以作為篩選高產突變株的出發菌株。

2.4 優良重組子的篩選

2.4.1 Cerulenin初篩高產油脂突變株

Cerulenin是一種藍色頭孢霉的自然代謝產物，它通過與脂肪酸合成酶中 β-酮脂酰-ACP合酶末端絲氨酸上的-SH基結合，形成羥基內酰胺環而使之失活。β-酮脂酰-ACP合酶是脂肪酸合成的關鍵酶，故低濃度的Cerulenin能夠不可逆地抑制生物體的內源性脂肪酸合成，從而抑制細胞的生長代謝。在一定濃度的Cerulenin培養基上，只有脂肪酸合成酶活性比較高的菌株才能存活下來而被選出[11]。

圖2 單菌落酵母轉化子在X-gal板上的顯色結果Fig. 2 The color result of transformant colony on X-gal plate.(a) The number of P38plasmid (13), P26(7), P31(3), P34(2). (b)The number of P37plasmid (23). (c) The number of P24plasmid(5), P26 (recovery) (43). (d) The number of P35plasmid (10),P25 (15), P22 (8). (e) The number of P26plasmid (16), P27 (16),P29 (5).

經試驗確定當2.24×10?3mol/L Cerulenin的量達到60 μL時，菌落形成率約為3%，以此濃度作為篩選最佳劑量。得到的重組子中，在Cerulenin作用下有部分菌落比出發菌株存活率高，相同Cerulenin抑制濃度下，選取菌落形成率比出發菌株大的作為初篩菌株，從32株菌中得到了15株可能高產油脂的突變株。

2.4.2 磷酸香草醛反應法分析初篩突變株

經過發酵產脂的酵母經處理后進行磷酸香草醛反應，會生成一種有色物質，其反應體系的顏色從淺綠色到茶紅色，隨油脂含量的增加而加深[10]。將初篩后的15個重組子經過產脂培養，其菌體通過磷酸香草醛反應后，反應顏色有明顯變化，根據顏色深淺可以判斷其含油率高低，從15株初篩突變株中選出10株顏色較深的突變株進行OD值測定和油脂含量測定。

發酵產脂的酵母經處理后進行磷酸香草醛反應后，其在530 nm處的光吸收值與氯仿甲醇抽提法測得的菌體油脂含量成正比，測得結果見表2。

表2 磷酸香草醛反應法測定的初篩突變株OD530值和油脂含量Table 2 OD530results and lipid content results of primary screening mutants by the methods of phosphate and vanillin reaction

由表 2 可以看出，2.1368-Leu?-1、2.1368-Leu?-2、2.1368-Leu?-4 、 2.1368-Leu?-5 、 2.1368-Leu?-16 、2.1368-Leu?-7、2.1368-Leu?-8這幾個突變株的 OD值和油脂含量大于Ck (原始菌株) 或者和對照相當，并且各重組子在 530 nm處的光吸收值與油脂含量基本上呈正相關。所以篩選這幾株菌進行玉米秸稈糖化液發酵試驗。

2.4.3 發酵試驗復篩高產突變株

將上述 7個突變株進行玉米秸稈糖化液發酵試驗，研究這7株突變對玉米秸稈糖化液的耐受性及利用纖維質原料生產微生物油脂的轉化效率。發酵結果如表3所示。

表3 突變株在秸稈糖化液培養基中的發酵結果Table 3 The fermentation results of the mutants under stalk saccharified liquid

由表3可以看出，發酵后這7個突變株的生物量均低于對照，其中突變株 2.1368-Leu?-1、2.1368-Leu?-2、2.1368-Leu?-4 的生物量低于 10 g/L，可能是由于突變株對秸稈糖化液中的有毒物質比較敏感，導致生長受到抑制；突變株2.1368-Leu?-7的油脂含量最高，為 38.30%，比對照的 29.33%高了8.97%，并且2.1368-Leu?-7的產油率最高，為8.35%，而對照為6.92%，產油率比對照提高了20.63%。可以確定2.1368-Leu?-7為最佳高效產油突變株。

在2.1368-Leu?-7進行玉米秸稈糖化液的發酵試驗中，其殘余總還原糖為1.20%，糖利用率為77%；每g糖可轉化油脂1.60 g；每100 g秸稈轉化油脂8.32 g。為微生物油脂的工業化奠定基礎。

3 討論

通過試驗，確定最佳熱激時間為20 min。將15個轉座子標簽插入文庫質粒在最佳熱激時間下轉化2.1368-Leu?，在 SD篩選平板上得到的 166株轉化子。其中成功實現轉化的質粒為P22、P24、P25、P26、P27、P29、P31、P34、P35、P37、P38。

利用LacZ顯色反應，根據其顯色水平，對166株轉化子進行同源重組載體進行篩選，得到 139株同源重組子。作為篩選高產菌的出發菌株。

利用Cerulenin和磷酸香草醛反應篩選高產油脂酵母菌，并對初篩菌株進行玉米秸稈糖化液發酵試驗驗證。最終確定 7號菌為最佳高效產油菌株，其油脂含量為38.30%，比對照的29.33%高了8.97%，而其產油率為 8.35%，比對照的 6.922%提高了20.63%；而在玉米秸稈糖化液中殘余總還原糖為1.20%，糖利用率為77%；每g糖可轉化油脂1.60 g；每100 g秸稈轉化油脂8.32 g。

本文參考文獻[9]和[13]，將幾種酵母轉化方法進行比較和改進，最終確定了最佳轉化方法。在酵母轉化過程中發現導致轉化率低的因素很多，如PEG濃度、熱激時間、單鏈載體、質粒 DNA濃度等。通過多次試驗發現，混合液中質粒 DNA添加4~5 μL (0.6 μg左右) 最佳，濃度較高時轉化效果并不理想，這可能是線性化質粒串聯整合所致。

利用Cerulenin篩選高產油脂酵母，可以實現酵母的高通量篩選，方便易行，是一種比較理想的油脂酵母篩選方法。在磷酸香草醛反應中，生物體與磷酸香草醛試劑反應，生成一種紅色物質，其機理尚不清楚，但根據反應顏色的深淺即可以定性分析油脂含量的高低，該方法需要的生物量小，且無須細胞破碎便可直接對細胞油脂含量進行定性分析，快速方便，具有很好的應用前景。

本文僅完成了利用轉座子標簽插入突變篩選高產油脂突變株 2.1368-Leu?-7，初步分析該突變株仍是發酵性絲孢酵母。突變株的獲得，這只是酵母功能分析的第一步。要對酵母突變株進一步研究，需要通過拯救質粒pRSQ2-URA (實驗室已具有) 法確定轉座子標簽插入位點，根據拯救質粒全序列設計并合成引物對驗證過的質粒測序，將測序結果與釀酒酵母基因組全序列數據庫進行Blast分析，確定各轉座標簽的插入位點，進而對插入位點基因進行深入分析。

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Journals.im.ac.cn

Screening of high lipid production Trichosporon fermentans mutants by transposon tagging mTn-lacZ/leu2 insertion

Andong Song1*, Yubo Liu1*, Hui Xie1, Fengqin Wang1, and Xiaoming Bao2
1 Life Science College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
2 State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China

Received: November 24, 2010; Accepted: February 23, 2011

Supported by: Key Scientific and Technological Projects of Henan Province (No. 092102210110).Corresponding author: Xiaoming Bao. Tel: +86-531-88365826; E-mail: bxm@shu.edu.cn Andong Song. Tel: +86-371-63555153; Fax: +86-371-63555790; E-mail: song1666@126.com

*These authors contributed equally to this study.

河南省重點科技攻關項目 (No. 092102210110) 資助。