無機碳源對小球藻自養產油脂的影響

鄭洪立，高振，張齊，黃和,3，紀曉俊，孫洪磊，竇暢

1 南京工業大學生物與制藥工程學院，南京 210009

2 南京工業大學食品與輕工學院，南京 210009

3 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

4 中國石油天然氣股份有限公司石油化工研究院，北京 100029

無機碳源對小球藻自養產油脂的影響

鄭洪立1，高振2，張齊1，黃和1,3，紀曉俊1，孫洪磊4，竇暢1

1 南京工業大學生物與制藥工程學院，南京 210009

2 南京工業大學食品與輕工學院，南京 210009

3 材料化學工程國家重點實驗室，南京 210009

4 中國石油天然氣股份有限公司石油化工研究院，北京 100029

旨在研究小球藻利用無機碳自養產油脂，考察了3種無機碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2) 及其初始濃度對小球藻產油特性的影響。結果表明，小球藻能利用Na2CO3、NaHCO3和CO2產油；經Na2CO3、NaHCO3和CO2培養10 d后，隨著每種無機碳源濃度的增加，小球藻產量均先增加后減少。小球藻經3種無機碳源培養后，其培養液pH值上升。最適宜的Na2CO3和NaHCO3添加量均為40 mmol/L，其生物量分別達到0.52 g/L和0.67 g/L，產油量分別達到0.19 g/L和0.22 g/L。在3種無機碳源中，CO2是最佳無機碳源，當CO2濃度為6%時，小球藻生長最快，生物量達2.42 g/L，產油量最高達0.72 g/L；當CO2濃度過低時，無機碳供應不足，油脂產量低；當CO2濃度過高時，培養液pH偏低，小球藻油脂積累受到抑制。Na2CO3和NaHCO3較CO2更有利于小球藻積累不飽和脂肪酸。

小球藻，自養，無機碳，生物柴油

Abstract:We studied the effects of three inorganic carbon sources, Na2CO3, NaHCO3and CO2, and their initial concentrationson lipid production of Chlorella vulgaris. Chlorella vulgaris could utilize Na2CO3, NaHCO3and CO2to produce lipids. After 10-day cultivation with each of the three inorganic carbon sources, lipid yield of Chlorella vulgaris reached its peak with the concentration increase of the inorganic carbon source, but dropped again by further increase of the concentration. The pH value of the culture medium for Chlorella vulgaris increased after the cultivation on inorganic carbon source. The optimal concentration of both Na2CO3and NaHCO3was 40 mmol/L, and their corresponding biomass dry weight was 0.52 g/L and 0.67 g/L with their corresponding lipid yield 0.19 g/L and 0.22 g/L. When the concentration of CO2was 6%, Chlorella vulgaris grew the fastest and its biomass dry weight was 2.42 g/L with the highest lipid yield of 0.72 g/L. When the concentration of CO2was too low, the supply of inorganic carbon was insufficient and lipid yield was low. A too high concentration of CO2caused a low pH and lipid accumulation was inhibited. Na2CO3and NaHCO3were more favorable for Chlorella vulgaris to accumulate unsaturated fatty acids than that of CO2.

Keywords:Chlorella vulgaris, autotrophy, inorganic carbon, biodiesel

目前人類使用的能源主要是化石能源，而化石能源存在不可再生、其使用后造成環境污染、危害人類健康、CO2排放等嚴重的問題，開發化石能源的替代能源已經成為科技工作者的當務之急[1-2]。生物柴油以其可再生、環境友好、安全的特性，被視為本世紀最具發展潛力的新能源之一。生物柴油的原料有很多，但是相比之下，微藻油脂作為生物柴油原料有其獨特的優勢，因微藻光合作用效率高、生長周期短、單位面積產量大、易于培養、油脂含量高、減排 CO2，而且能將產油脂與太陽能利用、廢水凈化相結合；微藻生物柴油已成為國內外科學家的研究熱點[3]。

小球藻是一種富含油脂的微藻[4]，其油脂是以CO2為光合作用反應物經一系列代謝而合成。研究報道表明[5]，小球藻還能利用細胞表面的碳酸酐酶將轉化成CO2供RUBPase固定，因此小球藻只能固定水中 CO2和兩種形式的溶解無機碳。目前，小球藻生物柴油研究過程中采用的碳源一般為無機碳源，所用無機碳源多為 CO2，研究多集中于 CO2濃度優化[6]、通 CO2速率對小球藻產油的影響[7]，在小球藻利用 CO2產油研究方面已取得了較大進展。和形式的無機碳源對小球藻產油的影響未見報道。海水中存在 Ca2+、Mg2+等離子，會對Na2CO3、NaHCO3和CO2三種無機碳源在培養液中所形成的溶解無機碳形式及其比例產生影響。培養液中溶解無機碳形式及其比例影響小球藻對其中和 CO2的利用，因而 Na2CO3、NaHCO3和 CO2三種無機碳源會影響小球藻生長及其油脂合成代謝。而目前尚未見有關不同無機碳源(Na2CO3、NaHCO3和 CO2) 及其初始濃度對海洋小球藻光合作用及其油脂合成代謝、脂肪酸分布影響的報道。

本文以海洋小球藻為實驗對象，研究 3種無機碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2) 及其各初始濃度下小球藻的產油特性，并分析脂肪酸組成的差異，旨在提高小球藻對無機碳源的利用效率及其產油效率，為自養小球藻工業化高產油脂和減排 CO2提供理論基礎和實驗依據，推動微藻生物柴油的發展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藻種：試驗所用的小球藻 Chlorella vulgaris LICME001 (中國典型培養物保藏中心編號：CCTCC No: M 209256) 由南京工業大學工業催化與代謝工程實驗室保藏。

保種培養基：采用f/2液體培養基。

試驗培養基 (g/L)：海鹽 34，Na2EDTA 0.1，FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO40.1 和 KNO30.3。分別加入初始濃度為 0、20、40、60和 80 mmol/L的Na2CO3或NaHCO3，或通入濃度為0、3%、6%、9%和 12%的 CO2(供氣采用高純 CO2鋼瓶與高純N2鋼瓶，CO2和N2氣體混合用氣體混合器來實現，通氣量為 0.3 vvm)，以研究不同無機碳源下小球藻產油特性。以0.5 mol/L NaOH或HCl調節培養基的初始pH值。

1.2 試驗方法

搖瓶培養：根據試驗設計的要求，將對數期藻種細胞接種到250 mL三角瓶，接種量 (V/V) 為10%，在恒溫光照搖床中培養，條件為150 r/min，25 ℃，光照強度2 000 lx。

光生物反應器培養：將搖瓶中培養到對數期的藻種接種到反應器中，反應器為本實驗室自主設計的鼓泡式光生物反應器，反應器規格：體積為2 L (工作體積為1.5 L)；外置光源 (日光燈)，接種量 (V/V)為10%，整個培養過程光照強度為5 000 lx，光暗周期=12∶12，溫度為 (25±2) ℃，培養周期為 10 d。

1.3 分析檢測方法

葉綠素含量的測定：取5 mL藻液，低速離心收集藻細胞，用雙蒸水洗3 次，加入5 mL的100%甲醇溶液，用移液器吹吸均勻，室溫避光靜置1 h后，8 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清，測定OD652及OD665值。根據下列公式分別計算出葉綠素a和b含量 (單位：mg/L)[8]：

pH值測定：取30 mL藻液于離心管中，用pH計 (雷磁 pHS-3D，上海精密科學儀器有限公司)測定。

生物量的測定：用UV-1200型紫外可見分光光度計 (上海美譜達儀器有限公司) 在680 nm處測定藻液光密度 (OD)，每天測定1次，根據標準曲線回歸方程 C (生物量干重)=0.560×OD680(R2=0.986) 換算成藻生物質干重。

產油量測定：待測定藻液經離心收集藻體后，藻體用蒸餾水洗滌3 次，經溶菌酶破碎 (破碎條件：50 ℃，10 h，酶用量：50 mg/L)，提取油脂，油脂提取采用Bligh和Dyer法[9]，油脂重量測定采用稱重法[10]。試驗重復3 次，取平均值。

油脂組成 GC-MS檢測：分別取經 Na2CO3(濃度：40 mmol/L)、NaHCO3(濃度：40 mmol/L) 和 CO2(濃度：6%) 培養10 d的藻粉0.5 g，經提取油脂，采用 KOH-CH3OH甲酯化[11]，脂肪酸的氣相色譜-質譜定性定量分析參考文獻[12]。

2 結果與分析

2.1 三種無機碳源對小球藻生長的影響

2.1.1 三種無機碳源對小球藻光合色素的影響

葉綠素是小球藻的光合色素，其含量的高低直接影響光合作用效率[13]。圖 1為不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2對小球藻葉綠素 a和 b含量的影響。由圖1可見，經過10 d培養，當Na2CO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時，葉綠素a含量從1.18 mg/L增加到6.16 mg/L，葉綠素b含量從0.15 mg/L增加到1.96 mg/L；當Na2CO3初始濃度為40 mmol/L時，其葉綠素a含量為6.16 mg/L和葉綠素b含量為1.96 mg/L，均達到各自的最高。培養10 d后，當NaHCO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時，葉綠素a含量從1.14 mg/L增加到8.71 mg/L，葉綠素b含量從0.28 mg/L增加到3.08 mg/L；當NaHCO3初始濃度為40 mmol/L時，其葉綠素a和b含量均達到各自的最大值，分別為8.71和3.08 mg/L。隨著CO2濃度的增加，其對應的葉綠素a和b含量均分別呈先增加后下降的趨勢；當CO2濃度為6%時，其葉綠素a含量為18.14 mg/L，葉綠素b含量為6.02 mg/L，均達到各自的最大值。三種無機碳源培養后，葉綠素 a與 b的比例為2∶1~4∶1。

三種無機碳源中，直接通 CO2時葉綠素含量最高，說明最有利于小球藻光合作用；實驗過程發現：添加Na2CO3和NaHCO3時，培養液變渾濁，這可能與培養液添加了海鹽，所使用的海鹽中含有Mg2+、Ca2+等離子有關；試驗中添加的Na2CO3和NaHCO3與海鹽中的Mg2+、Ca2+等離子形成了MgCO3、CaCO3等沉淀，從而影響了小球藻光合作用過程中無機碳的供給和光合色素合成。而通入 CO2培養液沒有變渾濁，說明沒有形成沉淀，因此小球藻無機碳源的供給不受影響，其光合色素合成不受影響，光合作用效率高。在藻培養過程中 NaHCO3有兩個作用：一是作為無機碳源，二是調節培養液pH值，保持堿性環境，可抑制污染生物繁殖，保證藻養殖質量。Yoo等的研究也表明無機碳源的供給影響小球藻的生長[6]。

2.1.2 三種無機碳源對小球藻培養結束時pH值的影響

將培養液的初始pH調至7.2，接種海洋小球藻藻種，培養10 d后，測定其培養液pH，各小球藻培養液的pH值見圖2。經過10 d培養，當Na2CO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時，pH值從7.6上升到9.2；當Na2CO3初始濃度為40 mmol/L時，其pH值達到最高為9.2。培養10 d后，當NaHCO3初始濃度從0 mmol/L增加到80 mmol/L時，pH值從7.7上升到9.8；當NaHCO3初始濃度為40 mmol/L時，其pH值達到最高為9.8。隨著CO2濃度的增加，其對應的 pH值呈先增加后下降的趨勢；當 CO2濃度為6%時，其pH值達到最大為9.5。較初始pH值，小球藻經不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2培養10 d后，其培養液pH值均上升，即出現pH漂移現象，但漂移程度不同。研究結果表明，在不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2培養下，小球藻生長越快，其 pH漂移越明顯 (圖2、3)。隨著 pH的升高，小球藻生長變緩，說明改變后的pH可能已經偏離該藻的最佳生長范圍。

圖1 三種無機碳源對葉綠素含量的影響Fig. 1 Effect of three kinds of inorganic carbon source on chlorophyll content of Chlorella vulgaris.

圖2 三種無機碳源對小球藻培養液pH的影響Fig. 2 Effect of three kinds of inorganic carbon source on the pH of Chlorella vulgaris culture medium.

圖3 三種無機碳源對小球藻生物量的影響Fig. 3 Effect of three kinds of inorganic carbon source on biomass of Chlorella vulgaris.

本研究結果表明三種無機碳源培養小球藻，出現pH漂移現象。這是由于小球藻在密閉光生物反應器中一定pH值的添加海鹽培養液及適宜溫度、光照等條件下連續照光，隨小球藻光合作用對無機碳的利用，水中無機碳不斷減少，導致pH值不斷升高，故出現pH漂移的現象[14]。pH影響培養液中HCO3?、CO2和的存在形式和比例，為消除培養液初始pH值差異的影響，本實驗3種無機碳培養液初始pH均調為7.2，此時培養液中HCO3?、CO2和存在形式和比例是一樣的[15]。實驗結果 (圖3) 表明通 CO2最有利于小球藻對溶解無機碳的利用，NaHCO3次之，Na2CO3利用效果最差。這是由于在配培養液時 (調初始pH前)，NaHCO3和Na2CO3與培養液所添加海鹽中的 Mg2+、Ca2+等形成了沉淀，添加Na2CO3所形成的沉淀比NaHCO3多 (根據培養液的渾濁程度判斷)，而通CO2沒有形成沉淀；故添加 NaHCO3、添加 Na2CO3和通 CO2培養液中所含HCO3?、CO2和的摩爾數不一樣，通 CO2培養液所含、CO2和的摩爾數＞添加NaHCO3培養液＞添加 Na2CO3培養液。培養液 pH影響溶解無機碳形式及其比例，當海水pH值小于6時，溶解無機碳以和CO2兩種形式存在，其中以CO2形式為主；當海水pH值介于6和9之間時，溶解無機碳以、CO2和CO32?三種形式存在，其中以形式為主；當海水 pH值大于 9時，溶解無機碳以和CO32?兩種形式存在，其中以形式為主[15]。而小球藻只能固定 CO2和兩種形式的溶解無機碳[5]，本實驗pH漂移影響小球藻對溶解無機碳的利用，故pH漂移影響小球藻的生長和產油。因此，對小球藻利用無機碳源產油的后續研究應進一步調控培養液pH，以期得到更理想的單位產油量。

2.1.3 三種無機碳源對小球藻生物量的影響

圖3為不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2對小球藻生物量的影響。從圖 3中可以看出，當Na2CO3初始濃度為0~80 mmol/L時，各初始濃度對小球藻生物量的影響趨勢相近，接種后 2 d內，各濃度的生物量沒有差異；2 d后，隨著培養天數的增加，各濃度的生物量均呈先增加后達到穩定，生物量在培養 7 d左右達到穩定，各濃度的最大生物量介于 0.16~0.52 g/L之間。當 NaHCO3初始濃度為0~80 mmol/L時，各初始濃度下小球藻生物量增長趨勢相近，接種后 2 d內，各濃度的生物量沒有差異；2 d后，隨著培養天數的增加，各濃度的生物量均呈先增加后達到穩定，生物量在培養 7 d左右達到穩定，各濃度的最大生物量介于0.16~0.67 g/L之間。當CO2初始濃度為0~12%時，各初始濃度下小球藻生物量增長趨勢相近，接種后2 d內，各濃度的生物量沒有差異；2 d后，隨著培養天數的增加，各濃度的生物量均呈先增加后達到穩定，生物量在培養 9 d左右達到穩定，各濃度的最大生物量介于0.16~2.42 g/L之間。當Na2CO3、NaHCO3和CO2初始濃度分別為40 mmol/L、40 mmol/L和6%時，其生物量 (分別為：0.52、0.67和2.42 g/L) 均達到各自的最大值，分別是未添加無機碳的3.3、4.2和15.1倍；Na2CO3、NaHCO3和 CO2初始濃度過高或過低生物量均減少。

直接通 CO2生物量最高，說明最有利于小球藻生長；而Na2CO3作為無機碳源時生物量最低，說明最不利于小球藻生長。這可能與Na2CO3和NaHCO3作為碳源會與海鹽中 Mg2+、Ca2+等相關離子產生沉淀有關。在配培養液時，NaHCO3和Na2CO3與培養液所添加海鹽中的 Mg2+、Ca2+等形成了沉淀，添加Na2CO3所形成的沉淀比 NaHCO3多 (根據培養液的渾濁程度判斷)，從而添加 Na2CO3比添加 NaHCO3對小球藻利用無機碳源的影響更大；而通 CO2沒有形成沉淀，不影響小球藻對無機碳源的利用。本試驗研究表明適宜濃度的無機碳源有利于小球藻的生長；這與劉然等的研究結果一致[16]。

2.2 三種無機碳源對小球藻油脂的影響

2.2.1 三種無機碳源對小球藻油脂產量的影響

圖4 三種無機碳源對小球藻油脂產量的影響Fig. 4 Effect of three kinds of inorganic carbon source on lipid yield of Chlorella vulgaris.

不同初始濃度Na2CO3、NaHCO3和CO2對小球藻油脂產量的影響見圖4。由圖4可知，接種后前2天，各濃度油脂產量均不增加，此后隨著培養天數增加，對應的油脂產量均分別呈先快速增加后穩定增加；當Na2CO3、NaHCO3和CO2初始濃度分別為40 mmol/L、40 mmol/L和6%時，其對應油脂產量(分別為：0.19、0.22和0.72 g/L) 均達到各自的最大值；通CO2的最大油脂產量是添加Na2CO3、NaHCO3和未添加無機碳的 3.8、3.3和 12倍；Na2CO3、NaHCO3和 CO2初始濃度過高或過低均不利于油脂的合成。添加無機碳源較未添加的油脂產量高。

在三種無機碳源中，直接通CO2油脂產量最高，說明最有利于小球藻油脂積累；而Na2CO3作為無機碳源時油脂產量最低，說明最不利于小球藻油脂積累。在通入CO2過程中會形成對培養液的攪拌作用，攪拌作用一方面有利于藻細胞與培養液中營養物質等之間的充分接觸，同時可避免藻細胞在培養過程中下沉。另一方面有利于藻在反應器中暗、光照區的交換，提高其光合效率，因此促進小球藻的生長和油脂積累[17]。低或高濃度CO2均不利于油脂積累，這可能是由于 CO2是光合作用和油脂合成的底物，CO2濃度低則光合作用和油脂合成的底物供應不足。而CO2濃度過高則會引起培養液的pH過低[7]。pH下降勢必影響小球藻油脂合成過程中核酮糖1,5-二磷酸羧化酶、乙酰輔酶A羧化酶等關鍵酶活性。本研究還發現：通過馴化，可以顯著提高小球藻對CO2濃度的耐受能力；經過 5個馴化周期，小球藻耐CO2濃度可達10%以上，這有待進一步研究。

2.2.2 三種無機碳源對小球藻脂肪酸組成的影響

為考察三種無機碳源對小球藻脂肪酸組成的影響，利用 GC-MS檢測了最佳初始濃度 Na2CO3(40 mmol/L)、NaHCO3(40 mmol/L) 和 CO2(6%)對應小球藻主要脂肪酸的組成。由表1可得，培養10 d后，三種無機碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2)培養的小球藻所含主要脂肪酸種類相同，且其碳鏈長度均介于C14到C20之間，其中95%以上脂肪酸是C16和C18系列脂肪酸；三種無機碳源培養的小球藻不飽和脂肪酸含量均在 70%以上，而添加Na2CO3和NaHCO3其不飽和脂肪酸比例較通入CO2高。這可能與不利條件下生長的微藻其不飽和脂肪酸含量會增加有關[18]。研究表明生物柴油含有的脂肪酸主要是棕櫚酸 (C16∶0)、十六碳烯酸 (16∶1)、硬 脂 酸 (C18∶0)、 油 酸 (C18∶1) 和 亞 麻 酸(C18∶3)[19]，而以上 5種脂肪酸在本實驗小球藻脂肪酸中所占比例在90%以上，因此小球藻油脂是良好的生物柴油原料。

表1 三種無機碳源對小球藻脂肪酸組成 (占總脂肪酸含量的百分比) 的影響Table 1 Effect of three kinds of inorganic carbon source on fatty acids composition of Chlorella vulgaris (percent of total fatty acids)

3 結論

三種無機碳源及其初始濃度對小球藻生長及產油均具有顯著影響。Na2CO3、NaHCO3和 CO2均可作為小球藻自養產油脂的碳源，Na2CO3、NaHCO3和CO2最佳初始濃度分別為40 mmol/L、40 mmol/L和 6%，Na2CO3、NaHCO3和 CO2初始濃度過高或過低均不利于小球藻生長及產油。由于本實驗小球藻是海洋小球藻，所用海鹽中存在 Ca2+、Mg2+等離子，Na2CO3和NaHCO3作為無機碳源的效果較差。CO2是最佳無機碳源；CO2作為無機碳源不會與海鹽中的 Ca2+、Mg2+等離子形成沉淀，而向藻液中通入 CO2所形成的攪拌有利于小球藻受光、營養物質的吸收和防止小球藻細胞下沉。小球藻只能固定水中CO2和HCO3?兩種形式的溶解無機碳，但Na2CO3也可作為小球藻自養產油脂的碳源，說明其在水中溶解后可能含有 CO2和HCO3?兩種形式或其中某一種形式。小球藻葉綠素a與b的比例為2∶1~4∶1。小球藻經三種無機碳源培養后，其培養液 pH值上升。三種無機碳源 (Na2CO3、NaHCO3和CO2) 培養的小球藻所含主要脂肪酸種類相同，添加 Na2CO3和NaHCO3其不飽和脂肪酸比例較通入CO2高；三種無機碳源的脂肪酸95%以上是C16和C18系列脂肪酸，其不飽和脂肪酸含量均在70%以上，因此小球藻油脂是制備生物柴油的良好原料。

致謝：感謝中國石油天然氣股份有限公司資助！

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Effect of inorganic carbon source on lipid production with autotrophic Chlorella vulgaris

Hongli Zheng1, Zhen Gao2, Qi Zhang1, He Huang1,3, Xiaojun Ji1, Honglei Sun4, and Chang Dou1
1 College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China
2 College of Food Science and Light Industry, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China
3 State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering, Nanjing 210009, China
4 Petroleum Research Institute, China National Petroleum Corporation, Beijing 100029, China

Received: September 6, 2010; Accepted: February 21, 2011

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20936002), National Basic Rsearch Program of China (973 Program) (Nos.2007CB707805, 2009CB724700, 2011CB200906), the Fifth of Six Projects Sponsoring Talent Summits of Jiangsu Province, College Industrialization Project of Jiangsu Province, Program for Century Excellent Talents in University from the Ministry of Education of China (No. NCET-09-0157), Fok Ying Tung Education Foundation, Ministry of Education of China (No. 123014).

Corresponding author: Zhen Gao. Tel/Fax: +86-25-83172094; E-mail: gaozhen@njut.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 20936002)，國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (Nos. 2007CB707805, 2009CB724700, 2011CB200906)，江蘇省六大人才高峰項目，江蘇省高校科研成果產業化推進項目，教育部新世紀優秀人才支持計劃 (No. NCET-09-0157)，教育部霍英東教育基金資助(No. 123014) 資助。