城市生活廢水用于產油微藻培養

呂素娟，張維，彭小偉，陳曉琳，劉天中

1 中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003

2 中國科學院青島生物能源與過程研究所 生物燃料重點實驗室，青島 266101

城市生活廢水用于產油微藻培養

呂素娟1,2，張維2，彭小偉2，陳曉琳2，劉天中2

1 中國海洋大學食品科學與工程學院，青島 266003

2 中國科學院青島生物能源與過程研究所 生物燃料重點實驗室，青島 266101

將廢水與產油微藻培養結合起來，可以實現廢水的無害化處理，還可為微藻的培養提供營養組分和大量水源。利用高產油柵藻，以城市生活廢水為水源，在氣泡柱式光反應器中，考察了添加不同營養組分對柵藻細胞的生長、生物質產量、總脂含量以及氮磷去除情況的影響。結果表明：生活廢水非常適合于產油微藻的培養。利用生活廢水進行微藻培養中，僅需補充添加無機氮、無機磷、檸檬酸鐵銨以及微量元素。但這些營養組分的加入量對藻細胞的生長、生物量和油脂積累有重要影響。在優化的廢水培養基中微藻細胞濃度可達8.0 g/L左右，遠高于標準BG11培養基5.0 g/L的水平。微藻細胞對于無機氮與磷有著高的吸收能力，在廢水中加入185.25 mg/L以下無機氮，16.1 mg/L以下無機磷的條件下培養3~4 d后，培養液水體中未檢測到有氮磷殘留。由此表明利用城市生活廢水培養含油微藻可以在獲得微藻油脂產品的同時實現水體的氮磷無害化處理。

柵藻培養，城市生活廢水，氣泡柱式光反應器，微藻生物量，氮/磷去除

Abstract:Municipal wastewater is usually problematic for the environment. The process of oleaginous microalgal culture requires large amounts of nutrients and water. Therefore, we studied the feasibility of oleaginous microalgal culture of Scenedesmus dimorphus in bubbled column photobioreactor with municipal wastewater added with different nutrients. S. dimorphus could adapt municipal nutrient-rich wastewater by adding some nutrients as nitrogen, phosphorus, ferric ammonium citrate and trace elements,and the amounts of such nutrients have significant effects on cell growth, biomass yield and lipid accumulation. At optimum compositions of wastewater medium, the algal cell concentration could reach 8.0 g/L, higher than that of 5.0 g/L in standard BG11.Furthermore, S. dimorphus had strong capacity to absorb inorganic nitrogen and phosphorus from its culture water. There was almost no total nitrogen and phosphorus residues in culture medium after three or four days culturing when the adding mounts of nitrate and phosphate in wastewater medium were no more than 185.2 mg/L and 16.1 mg/L respectively under the experimental conditions. As a conclusion, it was feasible to cultivate oleaginous microalgae with municipal nutrient-rich wastewater, not only producing feedstock for algal biodiesel, but also removing inorganic nitrogen and phosphorus from wastewater.

Keywords:Scenedesmus dimorphus cultivation, municipal wastewater, bubbled column photobioreacter, algal biomass,nitrogen/phosphorus removal

隨著全球化石能源短缺和環境不斷惡化，生物柴油作為一種可持續的綠色能源形式，受到世界范圍內的廣泛關注。目前全球各國都在大力發展生物柴油產業，但其最大的“瓶頸”在于大規模低成本可持續性油脂原料的供應。微藻是一種浮游的光自養微生物類群，廣泛存在于海洋、湖泊、河流等水體環境中，其中有很多藻種在特定環境條件下，可以積累大量的油脂產物，用于生物柴油生產。同時由于其光合效率高、生長速度快、產油量高、吸收CO2作為碳源利用、不與民爭糧和不與糧爭地等優勢，因而具有比傳統油料作物更高的發展潛力[1-6]。一些學者甚至認為微藻培養是解決能源與環境問題的終極出路之一。

雖然微藻產油潛力巨大，但迄今為止尚未獲得商業化生產能源產品的途徑，而主要應用于高附加值產品經濟微藻和餌料藻的生產。微藻培養主要采用的是液體懸浮式的培養，水源、營養鹽等消耗大，培養成本過高使得微藻能源產品的生產成本過高。因此發展微藻生物能源技術，除了通過培養技術突破大幅度提高微藻產率外，解決廉價的水資源和營養鹽成本也是降低微藻培養成本的重要措施之一。人類社會生產和生活產生大量富含氮磷的廢水，這些廢水的無害化處理已成為環境保護的重要問題。微藻作為一種自然環境的凈化者，很早就被提出并應用于廢水中的無機氮磷以及金屬元素等污染物質的去除。因此在微藻生物能源技術中，利用廢水來培養產油微藻，既可以利用微藻對這些大量的富氮磷廢水實現高效無害化處理，還可為能源微藻生產油脂提供豐富廉價的營養與水資源，一舉兩得。

柵藻Scenedesmus sp.是一種高環境污染耐受性的微藻品種，常見于許多富營養的污水環境中，由于其高效的氮、磷利用率以及生長快速等特點，因此經常被用于微藻的廢水培養[7-9]。Kim等曾在2007年，利用添加豬舍發酵廢水的培養基在搖瓶中培養柵藻，生長速率、干重分別達到對照培養基培養的3倍和2.6倍[10]。Chinnasamy等在2010年從地毯廠污水中分離藻種，利用地毯廠污水和市政廢水在950 L跑道池中進行培養評價，每年每公頃具有生產 9.2~17.8 t的潛力，總脂含量為 6.82%[11]。Li等利用二級污水對柵藻在搖瓶中培養，達到干重0.11 g/L，總脂含量為 31~33%，油脂產率最高為0.008 g/(L·d)[12]。

從以往的研究看，人們往往希望通過利用高污染的工業廢水進行微藻培養，雖然意義巨大，但是由于其復雜的組成以及較高濃度污染物，抑制了微藻生長從而降低其生產潛力，故難以形成持續化的大規模供應。相比而言，城市生活廢水供應量巨大，從2000到2006年，我國城鎮人口增加了25.7%，生活廢水排放量也從 2000年的 220.9億 m3增加到2006年的296.6億m3，增長了34.3%[13-14]，而且由于已有的生活廢水管網體系的存在，更加易于形成規模化的供應，同時其污染程度相對較低，更適合于微藻生長。因此本研究利用一株高產油柵藻Scenedesmus dimorphus，通過高光效的氣泡柱式光生物反應器，研究其城市生活廢水培養的可行性，考察在廢水中添加不同的營養基質下藻細胞的生長、生物質產量、油脂積累以及營養物質的消耗狀況，以期為利用城市生活廢水培養產油微藻工藝的建立奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗用水

本實驗所用城市生活廢水取自山東青島市嶗山區張村河河南橋處污水排放口，取水時間為春季下午16:00左右。廢水經過孔徑為45 μm篩絹過濾，去除固形物；經高壓蒸汽滅菌后備用。測定滅菌后水的化學需氧量 (COD)、總氮 (TN)、總磷 (TP)、銨態氮 (NH4-N)、pH等，結果見表1。

1.2 藻種與培養

本實驗所用藻種為美國亞利桑那州立大學 Hu Qiang教授惠贈的產油柵藻S. dimorphus。

標準 BG11 培養基[15]組成 (單位 mg/L)：NaNO3，1 500；MgSO4·7H2O，75；CaCl2·2H2O，36；檸檬酸，6；Na2EDTA，1；檸檬酸鐵銨，6；Na2CO3，20；KH2PO4·H2O，40；微量元素 (A5): ZnSO4·7H2O，0.222；CuSO4·7H2O，0.079；MnCl4·4H2O，1.81；Na2MoO4·2H2O，39；Co(NO3)2·6H2O，0.049；H3BO3，2.86。

以標準BG11培養基培養處于對數生長期的柵藻為種子液，接種于300 mL氣泡柱式光反應器 (參數：外徑2.9 cm、內徑2.7 cm、柱高56.0 cm) 中，初始吸光度OD730為0.2±0.05，折合干重約 (0.1±0.01) g/L，于溫度為 (25±1) ℃，光強為 100 μmol/(m2·s) 條件下，連續通氣培養 (CO2含量為2%，空氣流速為60 L/h，由底部通入) 12 d。每2天取樣測定OD730以監測微藻細胞生長情況。培養結束后測定取樣測定藻細胞干重、總脂含量以及培養液中 TN、TP消耗量。每組實驗設2個平行對照。

1.3 分析方法

1.3.1 細胞生長與干重測定

全光譜掃描中，在730 nm波長下柵藻無光吸收峰，因此可通過測定 OD730來定性監測與比較柵藻細胞培養液密度。

5~10 mL (V) 藻液經預稱重 (W1) 的醋酸纖維膜 (Φ0.45 μm)，過濾、洗滌，于105 ℃下烘至恒重(W2)，培養液細胞濃度 (干重，DW(g/L)) 的計算式如下：

1.3.2 細胞總脂含量測定

細胞總脂含量測定采用重量法測定，以氯仿-甲醇共溶劑提取[16]。稱取凍干藻粉50 mg (準確到0.1 mg) (Wc)，加入7.5 mL甲醇/氯仿 (2∶1=V∶V)混合溶液，于37 ℃下振蕩提取24 h后，離心收集上層有機相；藻殘渣用7.5 mL混合溶劑重復提取一次。集合有機相，加入5 mL氯仿、9 mL水，使氯仿∶甲醇∶水=2∶2∶1.8 (V∶V∶V)，離心收集下層氯仿相，轉移至預稱重的小管中，氮氣保護下烘至恒重，得到總脂 (Total lipid，TLP) Wtl。藻細胞總脂含量為：

1.3.3 總氮、總磷的測定

柵藻培養液于8 000 r/min離心3 min 后，收集上清液用于總氮、總磷含量測定。總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法 (GB 11894-89，水質總氮的測定)，總磷采用過硫酸鉀氧化-鉬銻抗分光光度法測定 (GB 11893-89，水質總磷的測定)。

1.3.4 數據分析方法

數據采用統計軟件SPSS10.0進行單因素方差分析 (one-way ANOVA)，采用LSD和Tukey HSD法進行統計檢驗 (P＜0.05)。

表1 實驗所用生活廢水水質Table 1 Water quality of domestic wastewater used in the experiments

2 結果與分析

2.1 柵藻在不同水源培養基中的生長

為了考察天然廢水是否可以用于微藻培養，以OD730為細胞密度的指標，監測了柵藻在標準BG11、純廢水以及添加 BG11培養基全部營養成分的廢水中生長情況，結果如圖 1所示。在純廢水中，在前6天細胞可以獲得一定的生長增殖，但6 d之后即停止生長，最終12 d后OD730值僅可達3.0。相對而言，在標準BG11與廢水BG11培養液中，前8天細胞一直處于快速生長，之后進入穩定期，最終12 d后的OD730值分別達到8.37和10.5。收集了12 d培養后的藻細胞，測定其細胞干重，結果表明標準 BG11與廢水BG11培養條件下的單位體積培養液中細胞干重分別可達 (5.07±0.09) g/L和 (8.12±0.08) g/L，而純廢水培養下僅能達到 (1.94±0.26) g/L。由于純廢水中總氮與總磷僅為 (17.8±0.1) mg/L 和 (1.05±0.01) mg/L，遠遠低于標準 BG11中的氮磷濃度，因此，氮磷等營養元素的缺乏應該是導致廢水中微藻生長緩慢與生物量低的主要原因，向廢水中添加充足的營養元素有可能獲得好的培養效果。

圖1 不同水源的培養基對柵藻生長的影響Fig. 1 Growth of S. dimorphus in culture medium with different water resources.

2.2 廢水中添加不同營養成分對柵藻培養的影響

2.2.1 實驗設計

不同于標準 BG11是用自來水配制，廢水中除了氮磷外，本身還存在多種多樣的營養物質。為了降低培養基成本，我們以標準 BG11培養基各種營養母液和微量營養元素為基礎，考察廢水培養時哪些營養成分為微藻生長所必需，哪些非必需。實驗設置了如表2中所示的1~8組營養元素組合條件，添加量按1.2節中標準BG11培養基。考慮到自然水體中的鈣元素含量 (13.8~31.7 mg/L)[17]，遠高于BG11培養基中鈣含量 (7.87 mg/L)；同時柱式光反應器中培養微藻是連續通入 2% CO2的空氣，不會存在碳源的不足，因此，1~8組中均不加入CaCl2·2H2O 與 Na2CO3成分。

表2 廢水培養基營養元素篩選的實驗安排Table 2 Experimental arrangements for the determination of nutrients in wastewater medium

2.2.2 廢水中不同成分對柵藻生長和油脂積累的影響

如圖2所示，從第3、4、5、6、8組條件的OD730生長曲線看，在無鎂離子、檸檬酸、EDTA、鐵銨與微量元素添加的條件下，柵藻的生長同第 1組條件即全營養素添加的條件相比，無明顯的差異；而從第2與第7組的生長曲線來看，在無額外的無機氮與無機磷補加條件下，相比于其他組條件，柵藻的生長明顯受到限制，而且在第4天后就明顯停止生長。因此若單純從 OD730生長來分析，利用廢水培養柵藻，鎂離子、檸檬酸、EDTA、鐵銨與微量元素不必添加，而無機氮與無機磷則必須補充。

圖2 廢水添加不同營養素對柵藻生長的影響Fig. 2 Effects of different nutrients added in wastewater on the growth of S. dimorphus.

上述培養實驗12 d后收集培養液，測定不同培養基組成下的細胞干重濃度，結果如圖3所示。可以看出，第 1組全營養素添加條件下，培養 12 d后細胞干重可達 (8.77±0.03) g/L；相比而言，第3、4、5組條件下，細胞干重差異不大，分別可達(8.41±0.27) g/L、(8.42±0.23) g/L、(8.36±0.18) g/L；第 8組缺乏微量元素的情況下，細胞干重為(7.70±0.65) g/L，較上述3個條件低，表明微量元素對藻細胞的生產質產量也有較重要影響。第6組鐵銨缺乏條件下，細胞干重相對較低，只有(5.40±1.30) g/L；第2與7組的無機氮與磷缺乏條件下，生物量積累最低，分別僅可達 (1.59±0.03) g/L、(2.75±0.34) g/L。將上述結果進行數據分析，以F值判斷各因素對干重的影響水平，無機氮與無機磷對細胞干重的影響較大，且無機氮＞無機磷，二者置信度在 95%以上 (即 P＜0.05)，這與上述直觀分析相一致。

圖3還給出不同培養基組成培養12 d后收集的藻細胞總脂含量的變化。從圖中可以看出，與生物質產量受不同營養元素添加的影響不同，總脂含量在無額外磷條件下 (第7組) 最高，達到56.2%，其次為無額外氮 (第2組) 的培養條件為47.5%，與廢水全 BG11條件的 29.9%對比，說明在廢水培養柵藻時，氮、磷限制促進油脂積累，這與文獻報道的斜生柵藻在氮缺乏、磷缺乏的條件下總脂積累高于氮、磷充足的培養條件下總脂含量相一致[9]。無額外添加檸檬酸鐵銨 (第 7組) 條件下的總脂含量最低，為 23.5%，說明檸檬酸鐵銨的不足限制了細胞油脂的積累。將上述結果進行數據分析，所有因素對細胞總脂含量的影響置信度均在95%以上，在本實驗條件下的影響程度分別為：無機磷＞檸檬酸鐵銨＞(無機氮、鎂鹽、Na2EDTA)＞檸檬酸＞微量元素，這與上述直觀分析相一致。

圖3 不同條件下培養12 d后柵藻的生物質產量和總脂含量Fig. 3 Biomass production and total lipid content in different conditions after 12 days of cultivation.

綜上所述，從不同廢水培養基的微藻培養細胞干重以及總脂含量分析，無機氮、無機磷、檸檬酸鐵銨以及微量元素是影響廢水培養微藻生物量與油脂積累的重要營養組分，利用本實驗選用的城市生活廢水培養柵藻，無機氮、無機磷、檸檬酸鐵銨以及微量元素是必須添加的營養組分。為了進一步確定無機氮、無機磷、檸檬酸鐵銨等在廢水培養基中的添加量對細胞生物產生和油脂積累的影響，從而確定合理的營養鹽加入量。以上述生物質產量最高的第 1組營養素組合為基礎，設計單因素濃度梯度實驗，考察不同營養素濃度對柵藻生長的影響。

2.3 不同無機氮、無機磷、鐵銨鹽添加濃度下柵藻的生長

2.3.1 無機氮單因素實驗

以 BG11的氮濃度為基準，考察了向生活廢水分別添加 0.25、0.5、0.75、1、1.5和 2倍無機氮，即 61.75、123.5、185.25、247、370.5、494 mg/L 濃度條件下，柵藻廢水培養12 d后的藻細胞濃度 (干重)、總脂含量、培養基TN的消耗情況，結果如圖4和圖5所示。

“在翻譯過程中，有時譯者想把源語所承載的各種文化信息轉譯到譯入語中，因此“直譯”是他們的第一選擇。直譯帶有濃厚的源語文化痕跡”（趙德全，2009）。[14]

圖4 不同氮濃度的廢水BG11培養12 d后的藻細胞濃度與總脂含量Fig. 4 Biomass and total lipid content cultured in wastewater BG11 with different nitrogen gradients after 12 days of cultivation.

圖5 不同氮濃度的廢水BG11培養柵藻時的TN變化曲線Fig. 5 TN consumption in wastewater BG11 with different nitrogen gradients.

在 1倍氮條件下 12 d的廢水培養可以獲得(7.5±0.05) g/L 的生物量和 (26.1±2.2)%的油脂含量，2倍氮條件下生物量與總脂含量分別為(7.3±0.2) g/L、(23.4±2.2)%，表明繼續增加氮濃度，并不能提高最終的藻細胞濃度，反而對細胞內的油脂積累產生抑制作用。降低廢水培養基中的初始氮添加量，則利于細胞內油脂的積累，但細胞生長受到一定限制，最終細胞濃度偏低，生物量積累產生明顯的抑制趨勢，如在0.25倍BG11氮濃度的培養基中，總脂含量可達 (48.2±0.2)%，但生物量僅有(5.00±0.03) g/L。

另外，從圖5所示不同氮濃度的廢水培養基中TN的消耗過程曲線來看，接種后的前4天TN消耗最快。在這個時期，柵藻細胞快速的從培養液中攝取氮源供其快速生長。其中在0.25、0.5和0.75倍氮條件下，幾乎100%的TN被細胞吸附，在培養4 d后的培養液中甚至完全檢測不到氮的存在，同時0.75倍氮條件下，12 d培養獲得的生物量與油脂含量分別為 (7.3±0.2) g/L、(30.1±2.4)%，相比于1倍與 1.5倍氮條件，生物量并沒有明顯減少，同時油脂含量大大提高。

2.3.2 無機磷單因素實驗

以 BG11的磷濃度為基準，考察了向生活廢水分別添加 0.25、0.5、0.75、1、1.5和2倍無機磷，即 2.01、4.03、6.04、8.05、12.08、16.1 mg/L 濃度條件下，培養12 d后培養基中藻細胞濃度 (干重)、細胞內總脂含量和TP消耗情況，結果如圖6和圖7所示。

圖6 不同磷濃度的廢水BG11培養12 d后的藻細胞濃度與總脂含量Fig. 6 Biomass and total lipid content cultured in wastewater BG11 with different phosphorus gradients after 12 days of cultivation.

圖7 不同磷濃度的廢水BG11培養柵藻時的TP變化曲線Fig. 7 TP consumption in wastewater BG11 with different phosphorus gradients.

在 1倍磷條件下 12 d的廢水培養可以獲得(7.9±0.62) g/L的生物量和 (26.8±0.19)%的總脂含量，在 2倍磷的條件下，生物量與總脂含量分別為(7.4±0.24) g/L、(18.8±0.58)%。表明過高的磷濃度，并不能提高最終的藻細胞濃度，反而降低了細胞內的總脂含量。當培養基中的總磷濃度小于等于1倍磷時，細胞內的總脂含量變化不大，但低磷時由于細胞合成磷的不足會影響藻細胞的生長，生物量降低。

從圖7給出的不同總磷濃度的培養基中TP的變化來看，柵藻細胞對磷的吸收比對氮的吸收更快。培養3 d后，各個條件的培養基中都完全不能檢測到磷的存在，100%的磷都被藻細胞所攝取。

2.3.3 無機檸檬酸鐵銨單因素實驗

以 BG11的檸檬酸鐵銨濃度為基準，考察了向生活廢水分別添加 0.25、0.5、0.75、1、1.5和2倍檸檬酸鐵銨，即1.5、3、4.5、6、9、12 mg/L濃度條件下，柵藻廢水培養12 d后培養基中的藻細胞濃度 (干重) 和總脂含量，結果如圖8所示。

圖8 不同檸檬酸鐵銨濃度的廢水BG11培養12 d后的藻細胞濃度與總脂含量Fig. 8 Biomass and total lipid content cultured in wastewater BG11 with different ferric ammonium citrate gradients after 12 days of cultivation.

3 結論

本研究利用青島張村河排污口的生活廢水作為水源，以柵藻S. dimorphus為產油模式藻探討了在氣泡柱式光生物反應器培養的可行性。結果表明，該柵藻能夠很好地適應城市生活廢水。生活廢水中只需要添加適量的無機氮與磷，檸檬酸鐵銨和微量元素，即可較好地用于微藻的培養與油脂生產。氮、磷限制以及檸檬酸鐵銨對細胞總脂含量具有誘導作用。在廢水中添加247 mg/L無機氮、8.05 mg/L無機磷、4.5 mg/L檸檬酸鐵銨和足量微量元素的條件下，培養12 d微藻生物量和含油量可達8 g/L，38%左右的水平。同時，對培養中水體TN與TP殘留的檢測結果發現，微藻對無機氮與磷均有著高效的吸收機制，在合適的加入量下培養3~4 d后的水體，已經完全檢測不到氮與磷的存在。因此，城市生活廢水用于含油微藻的培養前景廣闊，僅通過部分營養元素的添加，即可獲得高密度與高含油的微藻生物質，而且使用后水體中無機氮與無機磷甚至低于原生活廢水水體，在產生巨大的經濟和社會效益的同時，還減輕了后續水處理中無機氮與無機磷難以去除的困難，可以緩解城市發展對環境保護的壓力，對于我國城鎮化發展具有重要意義。

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Cultivating an oleaginous microalgae with municipal wastewater

Sujuan Lü1,2, Wei Zhang2, Xiaowei Peng2, Xiaolin Chen2, and Tianzhong Liu2
1 School of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China
2 Key Laboratory of Biofuel, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China

Received: October 8, 2010; Accepted: December 28, 2010

Supported by: Key Scientific and Technological Projects of Shandong Province (No. 2008GG20007002), Solar Energy Strategy of Chinese Academy of Sciences (No. KGCX2-YW-374-4).

Corresponding author: Wei Zhang. Tel: +86-532-80662737; E-mail: zhangwei@qibebt.ac.cn Tianzhong Liu. Tel: +86-532-80662735; E-mail: liutz@qibebt.ac.cn

山東省科技攻關項目 (No. 2008GG20007002)，中國科學院太陽能計劃 (No. KGCX2-YW-374-4) 資助。