休哈塔假絲酵母HDYXHT-01利用木糖生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝優(yōu)化

葛菁萍，劉國明，楊曉峰，孫紅兵，凌宏志，平文祥

黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150080

休哈塔假絲酵母HDYXHT-01利用木糖生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝優(yōu)化

葛菁萍，劉國明，楊曉峰，孫紅兵，凌宏志，平文祥

黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 微生物黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150080

采用Plackett-Burman (PB) 方法和中心組合設(shè)計 (Central composit design，CCD) 對休哈塔假絲酵母Candida shehatae HDYXHT-01利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝進行優(yōu)化。PB試驗設(shè)計與分析結(jié)果表明：硫酸銨、磷酸二氫鉀、酵母粉和接種量是影響木糖乙醇發(fā)酵的4個關(guān)鍵因素，以乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)目標(biāo)，采用CCD和響應(yīng)面分析法 (Response surface methodology，RSM)，確定了木糖乙醇發(fā)酵的最佳工藝為：硫酸銨1.73 g/L、磷酸二氫鉀3.56 g/L、酵母粉2.62 g/L和接種量5.66%，其他發(fā)酵條件為：木糖80 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 5.0，培養(yǎng)溫度30 ℃，裝液量100 mL/250 mL，搖床轉(zhuǎn)速140 r/min，發(fā)酵時間48 h，在該條件下發(fā)酵液中乙醇產(chǎn)量可以達(dá)到26.18 g/L，是優(yōu)化前的1.15倍。

休哈塔假絲酵母，木糖，乙醇，響應(yīng)面分析法

Abstract:Plackett-Burman (PB) design and central composite design (CCD) were applied to optimize of xylose fermentation for ethanol production by Candida shehatae HDYXHT-01. The PB results showed that (NH4)2SO4, KH2PO4, yeast extract and inoculum volume were the main affecting factors. With ethanol productivity as the target response, the optimal fermentation was determined by CCD and response surface analysis (RSM). The optimal fermentation conditions were (NH4)2SO41.73 g/L, KH2PO43.56 g/L, yeast extract 2.62 g/L and inoculum volume 5.66%. Other fermentation conditions were xylose 80 g/L, MgSO4·7H2O 0.1g/L, pH 5.0 and 250 mL flask containing 100 mL medium and cultivated at 30 °C for 48 h and the agitation speed was 140 r/min. Under thisfermentation conditions, ethanol productivity was 26.18 g/L, which was 1.15 times of the initial.

Keywords:Candida shehatae, xylose, ethanol, response surface methodology

燃料乙醇作為一種安全、清潔的可再生代用燃料的出現(xiàn)，在一定程度上緩解了當(dāng)今的石油資源危機，己經(jīng)引起世界各國的高度關(guān)注。傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵工業(yè)主要以糖質(zhì)和糧食類淀粉質(zhì)為原料，而中國作為人口大國，糧食原料的供應(yīng)受到很大限制而且成本過高[1]，因此，以木質(zhì)纖維素類資源為原料代替糧食進行乙醇發(fā)酵，具有十分重要的現(xiàn)實意義[2-3]。木糖是木質(zhì)纖維原料水解產(chǎn)物中含量僅次于葡萄糖的一種單糖，含量可達(dá)到木質(zhì)纖維水解糖類的35%以上[4]。木糖的乙醇發(fā)酵一直被人們視為木質(zhì)纖維原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵因素，適宜的木糖發(fā)酵產(chǎn)率和乙醇濃度可以降低工藝總成本的 25%以上[5]，因此提高木糖的乙醇發(fā)酵產(chǎn)率是該技術(shù)商業(yè)化生產(chǎn)的必要條件。通常用于乙醇發(fā)酵的釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae只能發(fā)酵葡萄糖[6]，這樣就造成了木糖的浪費。自然界中目前已發(fā)現(xiàn)能發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的酵母菌主要有假絲酵母Candida、畢赤氏酵母Pichia和管囊酵母Pachysolen 3個屬[7]，它們雖然可以利用木糖，但它們對乙醇的耐受力以及發(fā)酵速率遠(yuǎn)不及釀酒酵母[8]。因此，提高這些菌株的乙醇耐受力及提高其發(fā)酵速率，成為提高木糖利用率的研究熱點。本文所用的休哈塔假絲酵母Candida shehatae HDYXHT-01，是能直接利用木糖進行乙醇發(fā)酵并被認(rèn)為最具有工業(yè)價值的菌種之一[9-10]，近幾年，人們將目光集中在提高該菌株的乙醇利用率上面，采用育種手段[11-12](包括誘變育種、定向馴化、原生質(zhì)體融合) 和優(yōu)化發(fā)酵條件[7,13]等方法，相繼獲得了一些優(yōu)良性狀的菌株。

本文以木糖為唯一碳源，將 Plackett-Burman(PB)[14]方法和中心組合設(shè)計 (Central composite design，CCD)[15]相結(jié)合，采用響應(yīng)面分析法 RSM(Response surface methodology)[16]，對休哈塔假絲酵母 HDYXHT-01木糖乙醇發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，以期提高該菌株對木糖的轉(zhuǎn)化率及乙醇得率。本研究初步摸索和確定了休哈塔假絲酵母 HDYXHT-01發(fā)酵木糖產(chǎn)生乙醇能力，其木糖利用率、木糖轉(zhuǎn)化率、乙醇耐受力及乙醇產(chǎn)量都處于較高水平，這有利于進一步利用該菌株進行誘變育種及發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物進行產(chǎn)醇研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

休哈塔假絲酵母Candida shehatae HDYXHT-01，黑龍江大學(xué)微生物重點實驗室提供，由本實驗室自行分離并保存，其發(fā)酵木糖的性能良好。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：木糖 20，蛋白胨20，酵母粉10，pH自然，108 ℃滅菌20 min。

木糖初始發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：木糖80，(NH4)2SO42，酵母粉 5，KH2PO45，MgSO4·7H2O 0.25，無水CaCl20.25，pH自然，108 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備

挑取斜面菌種一環(huán)，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、140 r/min培養(yǎng)24 h。

1.2.2 發(fā)酵液的制備

將種子液按 5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL三角瓶，在30 ℃、140 r/min以兼性厭氧的方式培養(yǎng)48 h。

1.3 分析方法

發(fā)酵液中的木糖及乙醇含量通過高效液相色譜(HPLC)進行分析。HPLC條件：分析系統(tǒng)為SCL-10A，包括LC-10ATvp泵，RID-10A示差檢測器以及 HPX-87H (300 mm×7.8 mm，Aminex HPX-87H Ion exclusion column) 色譜柱；分析條件為示差檢測器溫度40 ℃，色譜柱溫度65 ℃，流動相用0.005 mol/L H2SO4，流速為0.8 mL/min，上樣量20 μL，發(fā)酵液分析時間18 min。

發(fā)酵液處理：取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min離心10 min，保留上清液用于HPLC分析。

1.4 PB設(shè)計篩選顯著因子試驗

培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)條件對發(fā)酵結(jié)果有重要的影響。為了提高發(fā)酵過程的效率，需要對培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。根據(jù)本實驗室的單因素試驗結(jié)果確定，硫酸銨、酵母粉、磷酸二氫鉀對發(fā)酵結(jié)果影響較顯著，此外還進一步考察pH值、接種量、培養(yǎng)溫度和裝液量等培養(yǎng)條件因素影響是否顯著。

本試驗應(yīng)用PB試驗設(shè)計篩選顯著因子，選擇硫酸銨 (X1)、磷酸二氫鉀 (X2) 和酵母粉 (X3)、pH值(X4)、接種量 (X5)、培養(yǎng)溫度 (X6) 和裝液量 (X7) 這7個因子，以及X8、X9、X10、X11這4個虛擬因子，以乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert 7.1.3軟件進行設(shè)計 (表 1)，篩選顯著性因素，并通過逐步回歸分析，獲得多元一次回歸方程。

表1 PB試驗設(shè)計因素及其水平取值Table 1 Experimental variables and levels of variables for PB design

1.5 中心組合設(shè)計 (CCD)

應(yīng)用 Design-Expert 7.1.3軟件，采用Box-Behnken的CCD方法[15]對PB篩選出的顯著因子進行試驗設(shè)計，同時固定其他因素。根據(jù)試驗所得數(shù)據(jù)進行方差分析和回歸分析并擬合獲得二次回歸方程，預(yù)測乙醇產(chǎn)量最大值及其所對應(yīng)關(guān)鍵因子的濃度。

1.6 響應(yīng)面模型的分析驗證

用 Design-Expert 7.1.3軟件將優(yōu)化試驗數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進行擬合，得到模型中的各個系數(shù)。對該多元二次方程進行性狀分析和方差分析，確定出其極值點以及取得極值的相應(yīng)自變量的取值，按照計算所得到的參數(shù)進行發(fā)酵驗證試驗，以驗證模型的可靠性，并確定最后的優(yōu)化結(jié)果。

1.7 發(fā)酵罐放大發(fā)酵試驗

按響應(yīng)面優(yōu)化的培養(yǎng)基組成配制發(fā)酵培養(yǎng)基，裝入5 L發(fā)酵罐，將培養(yǎng)好的種子液按優(yōu)化得到的接種量接入到發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐裝液量3 L，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速40 r/min，通氧量0.1 vvm，發(fā)酵周期48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB設(shè)計結(jié)果與分析

用PB設(shè)計篩選影響乙醇產(chǎn)量的顯著因素，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

采用 Design-Expert 7.1.3軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析 (表3)，獲得多元一次擬合回歸方程：Y=8.33+1.54X1+1.33X2+3.83X3+0.20X4+1.18X5?0.94X6+0.28X7，通常Prob (P)＞F值小于0.05視為顯著，此模型的P＞F值為0.0216，表明該模型顯著，模型在被研究的回歸區(qū)域擬合很好；負(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.9451，說明相關(guān)性較好，校正決定系數(shù) Adj R2=0.8490表明84.90%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋；變化系數(shù)CV越低，試驗的可信度和精確度越高，CV值等于17.24%，表示PB試驗的可信度和精確度較好；精密度 (Adeq precision) 是有效信號與噪音的比值，大于 4.0視為合理，本試驗精密度達(dá)到了9.539。

表2 PB試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of PB design

從表3中可看出，X1(硫酸銨)、X2(磷酸二氫鉀)、X3(酵母粉) 因子的 P＞F值均小于 0.05，為顯著影響因素，X5(接種量) 的P＞F值為0.0653，接近于顯著，其余因子不顯著，所以選擇X1、X2、X3和X54個因子進行中心組合設(shè)計。

表3 PB設(shè)計方差分析和回歸分析表Table 3 Variance analysis and regression analysis of the PB design

2.2 CCD優(yōu)化設(shè)計結(jié)果與響應(yīng)面分析

對PB試驗中篩選出的顯著因素硫酸銨、磷酸二氫鉀、酵母粉、接種量4因子采用Design-Expert 7.1.3進行中心組合設(shè)計，各因素水平取值見表4，其他因素取值則根據(jù)正效應(yīng)因素取較高值、負(fù)效應(yīng)因素取較低值 (即pH 5.0，溫度30 ℃，裝液量100 mL/250 mL)，共進行30次試驗，中心組合設(shè)計及結(jié)果見表5。

表4 中心組合設(shè)計因素及其水平取值Table 4 Experimental variables and levels of central composite design

采用 Design-Expert 7.1.3對中心組合設(shè)計試驗結(jié)果進行分析，獲得擬合二次多項式回歸方程：對回歸方程分析結(jié)果見表6，結(jié)果表明回歸方程一次項X1、X2和X4對乙醇產(chǎn)量的線性效應(yīng)顯著 (P＜0.05)，X1X4、X2X3對乙醇產(chǎn)量的交互作用顯著 (P＜0.05)，對乙醇產(chǎn)量的曲面效應(yīng)顯著?；貧w模型顯著(P＜0.0001)，可用來進行響應(yīng)值預(yù)測。F值為10.08，多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.9039，表明90.39%的乙醇產(chǎn)生的變化可以由此模型解釋，說明模型對實際情況擬合較好；校正決定系數(shù)Adj R2=0.8142表明81.42%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋。

表5 中心組合設(shè)計及其結(jié)果Table 5 Experiment design and results of central composite design

表6 中心組合試驗結(jié)果二階方差分析Table 6 Anove for response surface quadratic model

利用 Design-Expert 7.1.3軟件對上述模型進行了優(yōu)化處理，確定最優(yōu)硫酸銨1.73 g/L、磷酸二氫鉀3.56 g/L、酵母粉2.62 g/L和接種量5.66%，其他條件根據(jù)PB試驗選擇pH 5.0，溫度30 ℃及裝液量 100 mL/250 mL，MgSO4·7H2O根據(jù)單因素最佳值添加0.1 g/L，模型理論預(yù)測該條件下乙醇產(chǎn)量最大值為 26.30 g/L (圖 1)。

2.3 驗證試驗結(jié)果

為了驗證模型的可靠性，在最優(yōu)條件下，進行重復(fù)試驗4次，分別得到乙醇產(chǎn)量26.30、26.10、25.70、26.60 g/L，乙醇產(chǎn)量的平均值為26.18 g/L，與預(yù)測值 26.30 g/L非常接近，預(yù)測精度達(dá)到了99.54%，這表明試驗值和實際值間有很好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。優(yōu)化前在80 g/L木糖發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，乙醇產(chǎn)量為22.70 g/L，優(yōu)化后在同樣的條件下乙醇得率為0.41 g/g，乙醇產(chǎn)率0.55 g/(L·h)，木糖利用率79.81%，乙醇產(chǎn)量達(dá)到了26.18 g/L，是優(yōu)化前的1.15倍，這表明在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用 PB設(shè)計及響應(yīng)面設(shè)計對培養(yǎng)條件的優(yōu)化取得了良好的效果。

2.4 休哈塔假絲酵母 HDYXHT-01發(fā)酵罐放大試驗結(jié)果

以木糖為唯一碳源，利用5 L發(fā)酵罐為反應(yīng)器，按照優(yōu)化培養(yǎng)基配方進行了乙醇發(fā)酵試驗。得到了休哈塔假絲酵母HDYXHT-01發(fā)酵曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，休哈塔假絲酵母HDYXHT-01在發(fā)酵罐中，木糖利用率隨著發(fā)酵時間的延長而緩慢升高，48 h達(dá)最大值80.49%；在整個發(fā)酵過程中，乙醇的產(chǎn)量在前期增長得較慢，后期增長得較快，到發(fā)酵48 h，乙醇的產(chǎn)量達(dá)到最高為26.90 g/L；乙醇得率也隨發(fā)酵時間的延長而升高，在4~16 h增長較慢，從20 h以后增速加快，48 h達(dá)最大值0.42 g/g；乙醇產(chǎn)率從4~8 h增長較快，8~16 h幾乎變化很小，在20 h后開始增大，在48 h達(dá)最大值0.56 g/(L·h)。這個試驗結(jié)果初步說明了該菌株在進行發(fā)酵罐放大培養(yǎng)時，仍然具有較強的利用木糖產(chǎn)乙醇的能力，但由于發(fā)酵罐發(fā)酵條件和搖瓶不同，所以需要在今后的試驗中進行再次優(yōu)化，該試驗結(jié)果同時亦為該菌利用木質(zhì)纖維素水解液中的木糖奠定了一定的基礎(chǔ)。

圖1 乙醇產(chǎn)量的響應(yīng)面圖Fig. 1 Response surface methodology of ethanol productivity. (A) (NH4)2SO4(X1) vs KH2PO4(X2) with constant levels of yeast extract (X3) and inoculation volume (X4). (B) (NH4)2SO4(X1) vs yeast extract (X3) with constant levels of KH2PO4(X2) and inoculation volume (X4). (C) (NH4)2SO4(X1) vs inoculation volume (X4) with constant levels of KH2PO4(X2) and yeast extract (X3). (D) KH2PO4(X2) vs yeast extract (X3) with constant levels of (NH4)2SO4(X1) and inoculation volume (X4). (E) KH2PO4(X2) vs inoculation volume(X4) with constant levels of (NH4)2SO4(X1) and yeast extract (X3). (F) yeast extract (X3) vs inoculation volume (X4) with constant levels of (NH4)2SO4(X1) and KH2PO4(X2).

圖2 休哈塔假絲酵母HDYXHT-01發(fā)酵曲線Fig. 2 Fermentation curve of Candida shehatae HDYXHT-01.

3 討論

本研究通過響應(yīng)面設(shè)計和分析，對影響休哈塔假絲酵母 HDYXHT-01木糖發(fā)酵的 4個因素 (硫酸銨、磷酸二氫鉀、酵母粉和接種量) 進行了系列分析，獲得了以這 4個因素為自變量的二次多項式回歸方程：

對該模型進行優(yōu)化處理，確定了最佳發(fā)酵條件為硫酸銨1.73 g/L、磷酸二氫鉀3.56 g/L、酵母粉2.62 g/L、接種量5.66%、pH 5.0、溫度30 ℃、裝液量 100 mL/250 mL，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，模型理論預(yù)測該條件下乙醇產(chǎn)量最大值為 26.30 g/L。利用該優(yōu)化條件進行批次發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，乙醇平均產(chǎn)量為26.18 g/L，與預(yù)測值26.30 g/L非常接近，預(yù)測精度達(dá)到了99.54%，這表明試驗值和實際值間有很好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。

通過優(yōu)化發(fā)酵條件，試驗菌株的發(fā)酵性能得到很大提高，優(yōu)化前乙醇產(chǎn)量為22.70 g/L，優(yōu)化后達(dá)到26.18 g/L，是優(yōu)化前的1.15倍，這表明在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用PB設(shè)計及響應(yīng)面設(shè)計對培養(yǎng)條件的優(yōu)化取得了良好的效果。5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)48 h后，木糖利用率為80.49%、乙醇產(chǎn)量為26.90 g/L，乙醇得率 0.42 g/g、乙醇產(chǎn)率 0.56 g/(L·h)。對該菌株的乙醇耐受性進行研究發(fā)現(xiàn)，其乙醇耐受力為 3% (V/V)，其經(jīng)過乙醇耐受馴化后的菌株(YHFK-2，數(shù)據(jù)未顯示) 的乙醇耐受能力可以達(dá)到4% (V/V)。利用本試驗的優(yōu)化條件得到的乙醇產(chǎn)量也處于較高水平，周逢云等[11]在對休哈塔假絲酵母發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的試驗中，馴化篩選出一株TZ-8高產(chǎn)乙醇菌株，認(rèn)為在其最適發(fā)酵條件下 (木糖初始濃度40 g/L，溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速90~110 r/min，初始pH 4.5~5.0)，乙醇產(chǎn)量為11.02 g/L，乙醇得率為0.311 g/g，木糖利用率達(dá)到 86.9%。陳葉福等[12]對休哈塔假絲酵母 CICC1766進行了紫外線誘變，得到的突變株在木糖濃度為60 g/L的條件下，乙醇產(chǎn)量為23.64 g/L，相比原始菌株提高了14.98%，乙醇得率達(dá)到0.394 g/g；再對突變株進行氮離子注入誘變，得到了一株乙醇產(chǎn)量為25.08 g/L的突變株，乙醇得率為0.418 g/g，達(dá)到理論得率的90.8%。岳瑞雪等[7]利用休哈塔假絲酵母 CICC1766發(fā)酵 60 g/L木糖，其乙醇產(chǎn)量為20.52 g/L，乙醇得率為0.34 g/g，達(dá)到理論值的 74.5%，對乙醇的耐受能力為 3%(V/V)。由此可見，本文得到的發(fā)酵結(jié)果，木糖濃度和轉(zhuǎn)化率比文獻(xiàn)報道的都要高。

出發(fā)菌株較高的底物耐受能力，也是獲得高產(chǎn)菌株的必要前提。從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，休哈塔絲酵母在利用木糖產(chǎn)醇時，木糖利用率會受到木糖濃度的影響[7,11-12]，這是因為當(dāng)木糖質(zhì)量濃度較高時，會對與輔酶 NADPH相關(guān)的木糖還原酶(XR)的活力產(chǎn)生抑制作用，這種抑制作用會受到氧氣濃度及生成的木糖醇的含量影響[17]。在研究休哈塔假絲酵母 HDYXHT-01時也發(fā)現(xiàn)，木糖濃度越高，木糖的利用率越低，當(dāng)木糖濃度達(dá)到100 g/L時，木糖利用率只有65%左右，木糖濃度為80 g/L時，木糖利用率為 70.75%，這與林影等[13]的研究結(jié)果是類似的。但是對于 HDYXHT-01菌株來說，當(dāng)木糖濃度為80 g/L時，其乙醇產(chǎn)量和發(fā)酵強度卻是最高的，發(fā)酵到48 h時分別為22.70 g/L和0.39 g/(L·h) (未優(yōu)化前數(shù)據(jù))，并且在該木糖濃度下，利用本研究優(yōu)化的發(fā)酵條件，乙醇產(chǎn)量可以提高到26.18 g/L，乙醇得率達(dá)到理論值的 89.13%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他報道[7,11-12]。由此可見，休哈塔假絲酵母HDYXHT-01的較高乙醇產(chǎn)量與該菌株能適應(yīng)較高的底物濃度有一定的關(guān)系。

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Optimization of xylose fermentation for ethanol production by Candida shehatae HDYXHT-01

Jingping Ge, Guoming Liu, Xiaofeng Yang, Hongbing Sun, Hongzhi Ling, and Wenxiang Ping
Key Laboratory of Microbiology of Heilongjiang Province, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China

Received: October 13, 2010; Accepted: November 24, 2010

Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2007AA100702-6), National Natural Science Foundation of China (No. 31070446), Educational Commission of Heilongjiang Province (No. 11551z011), Key Scientific and Technological Projects of Heilongjiang Province (No. GA07B401-6), Special Fund for Scientific and Technological Innovative Talents in Harbin (No.RC2010XK002028), High-level Talents (Innovation Team) Projects of Heilongjiang University (No. hdtd2010-17).

Corresponding author: Wenxiang Ping. Tel/Fax: +86-451-86609016; E-mail: wenxiangp@yahoo.com.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2007AA100702-6)，國家自然科學(xué)基金 (No. 31070446)，黑龍江省教育廳重點項目 (No. 11551z011)，黑龍江省科技攻關(guān)重大項目 (No. GA07B401-6)，哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目優(yōu)秀學(xué)科帶頭人 (No. RC2010XK002028)，黑龍江大學(xué)高層次人才 (創(chuàng)新團隊) 支持計劃 (No. hdtd 2010-17) 資助。