乙酸分級預處理甘蔗渣對纖維素酶解性能的影響

趙雪冰，劉德華

清華大學化學工程系應用化學研究所，北京 100084

乙酸分級預處理甘蔗渣對纖維素酶解性能的影響

趙雪冰，劉德華

清華大學化學工程系應用化學研究所，北京 100084

為提高甘蔗渣的纖維素酶解性能，采用乙酸脫木素結合堿脫乙酰基的預處理工藝 (Acetoline工藝) 對甘蔗渣進行預處理，考察了乙酸脫木素過程中若干因素對預處理結果的影響，并對預處理后甘蔗渣的纖維素酶解性能進行了研究。結果表明，經過Acetoline預處理后甘蔗渣在7.5%固體含量、15 FPU+10 CBU/g固體的纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量下酶解48 h，酶解聚糖轉化率接近80%。與稀酸預處理相比，Acetoline預處理可以得到更高的酶解聚糖轉化率。實驗結果表明Acetoline工藝是一種可有效提高甘蔗渣纖維素酶解性能的預處理方法。

木質纖維素，預處理，酶解性能，脫木素，脫乙酰基

Abstract:During the bioconversion of lignocellulose to ethanol, the biomass always undergoes pretreatment in order to increase the enzymatic digestibility of cellulose. In present work, we conducted the pretreatment of sugarcane bagasse with aqueous acetic acid for delignification and alkali for deacetylation respectively (Acetoline process) to increase cellulose accessibility for enzymatic hydrolysis. The effects of several factors on the pretreatment effectiveness were investigated. The enzymatic digestibility of pretreated bagasse was further studied. The enzymatic glycan conversion of pretreated solid reached about 80% when it was digested under 7.5% solid consistency with cellulase of 15 FPU/g solid and β-glucosidase of 10 CBU/g solid for 48 h. Compared with dilute acid pretreatment, Acetoline pretreatment could obtain higher enzymatic glycan conversion. The experimental results indicate that Acetoline is an effective pretreatment method to increase the enzymatic digestibility of sugarcane bagasse.

Keywords:lignocellulose, pretreatment, enzymatic digestibility, delignification, deacetylation

近年來，從木質纖維素生物轉化生產燃料乙醇的研究與開發受到了世界各國的廣泛關注。這一方面是由于乙醇與汽油混合后可提高汽油的辛烷值和含氧量，使得汽油能夠更加完全地燃燒，從而減少顆粒污染物及CO等氣體的排放[1]。另一方面是由于乙醇不僅可以由淀粉質原料發酵生產，還可以由來源廣泛且價格低廉的木質纖維素生產。據估計，地球上每年光合作用的產物 (生物質) 高達1 500~2 000億t，是地球上唯一可超大規模再生的實物性資源[2]。同時，全生命周期分析表明纖維素乙醇生產可以顯著降低 CO2的凈排放量[3]。但由于木質纖維素的致密性和木質化結構阻礙了纖維素的酶催化水解。因此，將其進行酶解之前需要進行預處理以提高纖維素的酶解性能。目前人們已開發了多種預處理工藝，包括物理法、化學法、物理-化學法和生物法[4-7]，這些方法各有優缺點。從綜合利用木質纖維素各組分出發，有機溶劑預處理為木質纖維素的組分分離和高值化利用提供了一個很好的途徑[8]。有機溶劑預處理即是采用有機溶劑或其水溶液，在添加或不添加催化劑的前提下于一定溫度和壓力下對木質纖維素進行處理，其可獲得易于酶解的纖維素固體、半纖維素水解產物以及較高純度的木質素產品[8]。該預處理過程同時也是木質纖維素組分分離的過程，即所謂的分級預處理。在眾多的有機溶劑中，乙酸是可用于脫木素的最有前景的有機溶劑之一。這主要是由于乙酸預處理具有如下優點：1) 乙酸是木素的良好溶劑，對于木素具有較高的溶解度；2) 乙酸預處理可以在常壓下進行；3) 乙酸可通過蒸餾回收并循環使用；4) 預處理過程中半纖維素脫乙酰基產生的乙酸可作為溶劑損失的補充；5) 乙酸木素易于從黑液中回收。因此，已有不少文獻報道了采用乙酸水溶液進行木質纖維素制漿或組分分離的研究工作[9-11]，但以采用乙酸來預處理木質纖維素的過程卻鮮有報道。這主要是因為乙酸預處理過程中會導致纖維素乙酰化，從而抑制了纖維素的酶解反應[12]。本實驗室已開發了基于乙酸脫木素和堿處理脫乙酰基的預處理工藝(Acetoline工藝)，該工藝可以有效提高纖維素的酶解性能[13]。本文的目的即是考察基于乙酸脫木素的預處理過程中各因素對木素脫除率、聚糖水解率、乙酰基含量等目標響應變量的影響，并對預處理后的纖維素固體進行酶解性能測試。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用木質纖維素為甘蔗渣，產自廣西南寧市。甘蔗渣經風干后篩分除去蔗髓，取不能通過20目篩孔的部分進行實驗研究。經分析，其葡聚糖、木聚糖、阿拉伯糖基、乙酰基、克拉森木素、酸溶木素和灰分含量分別為40.48%、26.41%、1.17%、5.30%、22.64%、1.47%和 1.38%。所用纖維素酶為諾維信公司生產的Celluclast 1.5 L，經測定其纖維素酶活為38.5 FPU/mL。酶解過程中添加的β-葡萄糖苷酶亦為諾維信公司生產，其酶活為240 CBU/mL。所用化學試劑主要包括冰醋酸和98%硫酸，均為市售分析純。

1.2 預處理過程

乙酸脫木素過程在帶有機械攪拌的1 000 mL三口燒瓶中進行，其中一口與開口冷凝管相連。稱取30 g蔗渣置于燒瓶中，加入300 mL含有0.1~0.3 wt%硫酸的乙酸水溶液 (乙酸濃度為60%~90%)，然后將燒瓶置于電熱套中加熱至沸點反應1~3 h后停止加熱，過濾除去黑液。為避免或減少溶解木素的二次沉淀并沉積在纖維表面，所得固體先采用相同濃度的乙酸溶液進行洗滌，過濾后再用自來水洗滌至中性。當需要進行乙酰基脫除反應時，向洗滌后的固體中添加一定量的堿，攪拌均勻后于一定溫度下處理一定時間。為區別脫乙酰基的堿處理步驟，將乙酸脫木素步驟稱為“乙酸處理”，而整個預處理過程即稱為Acetoline預處理。

作為比較的稀酸預處理過程在5 L 316不銹鋼高壓釜中進行，預處理條件為：1%硫酸，10∶1液固比 (L/kg)，160 ℃下保溫30 min，升溫和降溫總時間為1.5 h。

1.3 預處理后纖維素固體的酶解

乙酸處理及Acetoline預處理后纖維素固體的酶解性能測試在50 mL三角瓶中進行。一定量的纖維素固體置于三角瓶內，加入一定體積含有纖維素酶的pH 4.8醋酸緩沖液，置于50 ℃、130 r/min的搖床中酶解120 h。纖維素酶的用量為5~40 FPU/g固體，β-葡萄糖苷酶的添加量為5~40 CBU/g固體。預處理后纖維素固體的酶解性能以酶解聚糖轉化率(EGC，%) 表征，其定義為：

其中，酶解產生的還原糖以纖維二糖、葡萄糖和木糖之和計。

1.4 分析方法

甘蔗渣和處理后固體中的主要成分根據美國可再生能源實驗室的方法進行測定[14]。纖維素酶酶活根據 Ghose的方法測定[15]，但以 HPLC代替 DNS法來測定還原糖濃度。所用HPLC儀器為日本島津公司生產，色譜柱為 Aminex HPX-87H柱 (美國Bio-Rad 公司生產)，分析條件為：5 mmol/L H2SO4為流動相，0.8 mL/min流速，柱溫65 ℃，差示折光檢測器。

2 結果與分析

2.1 乙酸處理正交實驗

為考察乙酸濃度 (CAcH)、催化劑硫酸濃度 (CSA)和反應時間 (t) 對乙酸處理中固體得率 (SY)、葡聚糖水解率 (GH)、木聚糖水解率 (XH)、木素含量(LC)、木素脫除率 (DD)、乙酰基含量 (AC) 以及酶解聚糖轉化率 (EGC) 的影響，以 L9(34) 正交表安排實驗，測定了不同因素水平組合下的響應變量值，結果如表 1所示。其中反應溫度為所用乙酸溶液的常壓沸點 (~107 ℃)，液固比為10∶1 (L/kg)。各因素對響應變量影響的水平趨勢圖見圖 1。可知，隨著乙酸濃度、硫酸濃度和反應時間增加，固體得率降低。固體得率的降低主要是由于聚糖水解以及木素脫除引起的。從圖1B和1C可知，隨著3個因素的水平值增加，葡聚糖水解率和木聚糖水解率均增加，但葡聚糖水解率顯著低于木聚糖水解率。此外，處理后固體中葡聚糖的含量隨著乙酸濃度、硫酸濃度和反應時間增加呈上升趨勢，而木聚糖含量呈下降趨勢。這是由于木聚糖更易于水解，同時加上木素的脫除使得葡聚糖得以“純化”的緣故。隨著此三因素水平值增加，乙酸處理后纖維素固體中的木素含量降低，相應的木素脫除率增加，表明增加乙酸濃度、硫酸濃度和反應時間有利于木素的脫除。方差分析結果表明，乙酸濃度和硫酸濃度對于木素脫除率有顯著影響，而反應時間的影響不顯著。實驗中發現大部分木素的脫除主要發生在第 1小時內，即第 1小時為主體木素脫除階段，木素脫除率隨時間變化明顯，而 1 h后為殘余木素脫除階段，木素脫除率隨時間變化不明顯。因此在所選的反應時間水平范圍 (1~3 h) 內反應時間對于木素脫除率無顯著影響。進一步對因素間的相互作用進行分析知此三因素間的相互作用對木素脫除率無顯著影響。從圖1E可知，乙酰基含量隨著硫酸濃度和反應時間增加呈降低趨勢，但隨著乙酸濃度增加呈顯著上升趨勢，表明乙酸濃度是影響纖維素發生乙酰化反應最為顯著的因素。但與甘蔗渣原料相比，在所研究的條件下乙酸處理后固體的乙酰基含量均有所降低 (甘蔗渣中的乙酰基含量為5.30%)。這是因為半纖維素中含有乙酰基，而乙酰基在酸性環境下會發生水解。因此乙酸處理后固體中乙酰基含量的變化受到脫乙酰基反應和乙酰化反應的共同作用。而且纖維素發生明顯乙酰化反應一般是在木素脫除率達到一定程度，纖維發生分離的時候才變得顯著。因此，關于乙酸處理過程中乙酰基含量的變化還需要進一步進行動力學研究。但從正交實驗結果來看，采用70%乙酸脫木素時，乙酰化反應不明顯。而采用90%乙酸脫木素時可觀察到明顯的乙酰化現象，預處理后纖維素固體的乙酰基含量大于 4%。對于乙酸處理后固體的酶解性能，從圖1F可知，隨著乙酸濃度、硫酸濃度和反應時間增加，酶解聚糖轉化率呈上升趨勢，這主要是由于隨著這些因素水平增加，木素脫除率隨之增加的緣故。但由于乙酸處理過程會導致乙酰化的發生，因此并非木素脫除率最高時得到最高的酶解聚糖轉化率。綜合來看，以80%乙酸添加0.3%硫酸的條件下反應較為合適。

表1 乙酸處理的L9(34) 正交實驗及結果Table 1 L9(34) experiments of acetic acid pretreatment

圖1 乙酸處理甘蔗渣過程中各因素對響應變量影響的水平趨勢圖Fig. 1 Effects of several variables on acetic acid delignification of sugarcane bagasse. (A) SY. (B) Glucan content and GH. (C)Xylan content and XH. (D) LC and DD. (E) AC. (F) EGC (enzymatic hydrolysis condition: 20 FPU+40 CBU/g solid, 2.5% (g/100 mL)solid consistency). The abbreviations are the same as table 1.

可見，乙酸脫木素過程中提高乙酸濃度、催化劑用量和反應時間有利于木素脫除，但同時也增加了預處理過程中聚糖的水解率和預處理后纖維素固體的乙酰基含量。因此，如在乙酸處理后采用少量堿進一步處理以脫除乙酰基，可進一步提高纖維素的酶解性能。同時，采用堿處理脫除乙酰基可以避免其在同步糖化發酵過程中水解生成乙酸，進而抑制菌體生長。

2.2 乙酸處理后堿脫乙酰基對甘蔗渣纖維素酶解性能的影響

從前面正交實驗的結果來看，乙酸處理過程中提高乙酸濃度有利于木素的脫除，但同時也增加了乙酰化反應的程度。Pan 等研究發現在木素含量相當 (約 18%) 時，乙酸制漿所得紙漿的酶解性能遠低于乙醇制漿所得紙漿的酶解性能。其主要原因是乙酰基的存在會阻礙纖維素與纖維素酶結合位點間的氫鍵形成，從而阻礙纖維素酶中具有催化功能的結構域與纖維素之間的結合；此外，乙酰基的存在增加了纖維素的酶促反應空間位阻[12]。因此有必要對乙酸脫木素后的纖維素固體進行脫乙酰基處理。為比較乙酸處理過程中乙酸濃度對后續堿 (NaOH)處理的影響，我們考察了采用80%乙酸在常壓沸點下脫木素 (A條件) 和 90%乙酸在常壓沸點下脫木素 (B條件) 這兩種情形時不同堿用量 (基于初始甘蔗渣重量) 的預處理，結果如表 2所示。可知，堿處理可以有效脫除乙酰基。當采用80%乙酸進行脫木素時，NaOH用量為2% (基于初始甘蔗渣重量)即可完全脫除乙酰基，而采用90%乙酸進行脫木素時，要完全脫除乙酰基，NaOH用量需提高至3% (基于初始甘蔗渣重量)。與對照樣相比，堿處理后固體得率和木素含量有所降低，而葡聚糖和木聚糖含量有所增加。從纖維素固體的酶解性能來看，隨著堿用量增加，初始酶解聚糖轉化速率 (IEGCR) 和120 h的酶解聚糖轉化率均顯著提高。特別地，當第一步采用90%乙酸進行脫木素時，未經堿處理的樣品初始酶解聚糖轉化速率僅有 1.09%/h，而采用 4%NaOH處理后，初始酶解聚糖轉化速率提高了9倍，相應的120 h酶解聚糖轉化率提高了1.6倍。可見，乙酸處理后采用堿處理來脫除乙酰基可以有效提高聚糖酶解速率和轉化率。因此，根據以上實驗結果，Acetoline預處理甘蔗渣較為合適的條件為： 采用80% 乙酸，0.3%硫酸，10∶1液固比在常壓沸點下處理2.0 h，進一步采用4% (基于初始甘蔗渣重量)的NaOH處理1 h，隨后用清水洗至中性。

2.3 Acetoline預處理后纖維素固體的酶解性能測試

為進一步研究Acetoline預處理對甘蔗渣纖維素酶解性能的影響，對預處理后的纖維素固體酶解性能進行了更為詳細地考察，從固體含量、纖維素酶用量及 β-葡萄糖苷酶用量等方面研究了酶解聚糖轉化率與酶解時間的關系，結果如圖2~4所示。

表2 乙酸處理后采用堿處理對預處理結果的影響Table 2 Effect of alkaline deacetylation after acetic acid delignification on pretreatment

圖2 固體含量對酶解聚糖轉化率的影響Fig. 2 Effects of solid consistency on enzymatic glycan conversion. Other enzymatic hydrolysis condition: 20 FPU+40 CBU/g solid.

固體含量是影響酶解過程中液相可發酵糖濃度的重要因素。提高固體含量可以提高可發酵糖濃度，進而提高發酵產品，如乙醇的濃度，降低分離成本。但固體含量增加會增加攪拌能耗以及產物對酶解過程的抑制作用[16]。從圖2可知，酶解時間小于24 h時，隨著固體含量增加酶解聚糖轉化率降低。而當酶解時間為120 h，固體含量小于7.5%時酶解聚糖轉化率無明顯區別，但固體含量提高至10%時，酶解聚糖轉化率明顯降低。Carrasco等研究汽爆預處理甘蔗渣酶解性能時也得到類似的結論[17]。比較酶解120 h后液相中的還原糖 (以纖維二糖、葡萄糖和木糖總和計) 濃度可知，固體含量為 2.5%、5%、7.5%和 10%時還原糖濃度分別為 21.4、43.6、61.6和74.9 g/L，相應的酶解聚糖轉化率分別為81.4%、84.7%、79.1%和71.2%。可見，提高固體含量雖然酶解聚糖轉化率有所降低，但可以顯著提高液相還原糖的濃度。

圖3 纖維素酶用量對酶解聚糖轉化率的影響Fig. 3 Effects of cellulase loading on enzymatic glycan conversion. Other enzymatic hydrolysis condition: 7.5% solid consistency.

纖維素酶用量是影響聚糖轉化速率和最終轉化率的一個重要因素。增加纖維素酶用量可以顯著提高酶解速率 (圖3)。當纖維素酶用量為5 FPU/g固體時，酶解48 h和120 h僅分別得到35%和50%的聚糖轉化率，而纖維素酶用量增加至20 FPU/g固體時，相同酶解時間下聚糖轉化率分別提高至70%和80%。進一步將纖維素酶用量增加至30 FPU/g固體，酶解初速率顯著提高，24 h后即可得到65%的聚糖轉化率，但酶解120 h的聚糖轉化率與纖維素酶用量為15 FPU/g固體時的相差不大。

圖4 β-葡萄糖苷酶對酶解聚糖轉化率的影響Fig. 4 Effects of β-glucosidase loading on enzymatic glycan conversion (other enzymatic hydrolysis condition: 7.5% solid consistency).

由于纖維素酶活性受到產物抑制，特別是纖維二糖的抑制作用最為強烈。其可結合在外切葡聚糖酶活性部位附近的色氨酸殘基上形成“位阻效應”，從而阻止纖維素分子鏈進入活性中心[18]。因此，在纖維素酶解過程中往往添加一定量的 β-葡萄糖苷酶以加快纖維二糖轉化為葡萄糖來消除其對外切葡聚糖酶的抑制作用。在酶解Acetoline預處理后的甘蔗渣過程中，添加一定量的 β-葡萄糖苷酶，結果如圖4所示。可見添加10 CBU/g固體的β-葡萄糖苷酶與未添加時的結果相比，聚糖轉化速率明顯增加。當纖維素酶用量為10 FPU/g固體時，酶解24 h得到45%左右的轉化率，而添加10 CBU/g固體的β-葡萄糖苷酶后，24 h的酶解聚糖轉化率提高至60%。類似地，在較高纖維素酶用量下添加10 CBU/g固體的β-葡萄糖苷酶亦能有效提高聚糖轉化速率，但繼續增加 β-葡萄糖苷酶用量時酶解聚糖轉化率并無明顯增加。可見，對于Acetoline預處理后的甘蔗渣酶解，在7.5%固體含量時添加10 CBU/g固體的β-葡萄糖苷酶已經足夠。

2.4 Acetoline預處理與稀酸預處理等方法比較

稀酸預處理木質纖維素是被人們所看好的最具有發展前景的預處理方法之一。我們進一步采用稀酸對甘蔗渣進行預處理，并與 Acetoline預處理進行比較，結果如圖5所示。Acetoline預處理后甘蔗渣酶解48 h后可得到接近80%的總酶解聚糖轉化率 (其中葡聚糖轉化率為 74.2%，木聚糖轉化率為89.1%)，而稀酸預處理的總酶解聚糖轉化率僅為50%左右 (其中葡聚糖轉化率為 51.1%，木聚糖轉化率為29.1%)。這主要是由于稀酸預處理過程雖然可以水解大部分的半纖維素，但僅有很少一部分木素溶解，絕大部分的木素仍殘留在預處理后的固體中。這些木素在酶解過程中會不可逆地吸附纖維素酶，造成有效酶濃度降低，從而降低了酶解速率和轉化率。根據實驗結果，稀酸預處理后固體中木素含量增加至40.6%，而Acetoline預處理后固體中木素的含量僅為 7.88%。可見，脫除木素對于提高纖維素酶解性能是很有效的。與文獻報道的預處理方法相比，Acetoline預處理亦可得到較好的酶解聚糖轉化率。Martin 等研究了濕氧化法預處理對甘蔗渣酶解性能的影響。當甘蔗渣在初始pH為10.0，195 ℃下處理15min，可得到最好的預處理效果。所得纖維素固體在固體含量為 2%、纖維素酶用量為25 FPU/g固體、β-葡萄糖苷酶濃度為0.46 CBU/mL(對應23 CBU/g固體) 條件下水解48 h聚糖轉化率為74.9%。而Acetoline預處理可以在更少的酶用量下得到更高的聚糖轉化率，可見Acetoline預處理可以有效提高纖維素的酶解性能。

圖 5 Acetoline預處理與稀酸預處理后甘蔗渣酶解聚糖轉化率比較Fig. 5 Comparison of the enzymatic digestibility of Acetoline pretreated sample and dilute-acid pretreated sample (other enzymatic hydrolysis condition: 7.5% solid consistency).

此外，Acetoline預處理亦消耗了堿，而堿處理本身也是一種很好的提高纖維素酶解性能的預處理方法，其主要是通過脫除木素來提高纖維素可及性的[5]。但由于Acetoline預處理中采用堿處理的目的是脫除乙酸脫木素步驟中引入的乙酰基，而乙酰基的脫除較木素的脫除容易得多，因此Acetoline預處理中的堿用量明顯低于堿處理中的量。當甘蔗渣僅采用20% (基于初始甘蔗渣重量) NaOH在121 ℃下處理1 h，所得纖維素固體在15 FPU/g固體的纖維素酶用量下酶解120 h可得到約70%的聚糖轉化率[19]，而堿用量降低至4% (基于初始甘蔗渣重量，與Acetoline中堿用量相同) 時酶解聚糖轉化率僅為23%左右。可見，Acetoline預處理中先采用乙酸脫木素可以更為有效地提高纖維素的酶解轉化率。另一方面，乙酸脫木素過程中可以將原料中近80%的木素抽提出來，這部分木素在后續的乙酸回收過程中可以以固體形式析出，即得到乙酸木素。與堿木素相比，乙酸木素由于具有更高的純度，同時更易于改性而具有更高的附加值。而堿處理木質纖維素過程中，堿木素回收相對較為困難且木素純度降低，因而限制了其改性和應用。

3 結論

基于乙酸脫木素、堿脫乙酰基的Acetoline預處理工藝可以有效提高甘蔗渣的纖維素酶解性能。乙酸處理脫除了大部分的木素，但也會不同程度造成纖維素的乙酰化。當采用 80%乙酸在添加 0.3%硫酸的條件下于常壓沸點處理2.0 h，可得到80%的木素脫除率，但乙酰基含量高達3.2%。乙酸處理后的固體采用清水洗滌至中性后繼續采用 4% (基于初始甘蔗渣重量) NaOH在120 ℃下處理1 h可以完全脫除乙酰基。與單獨的乙酸處理相比，Acetoline預處理顯著提高了聚糖的酶解速率及最終轉化率。從固體含量、纖維素酶用量和β-葡萄糖苷酶添加量對預處理后甘蔗渣的酶解性能進行了研究，結果表明Acetoline預處理后甘蔗渣在 7.5%固體含量以及15 FPU+10 CBU/g固體的纖維素酶和β-葡萄糖苷酶用量下酶解48 h，酶解聚糖轉化率接近80%，而經1%稀硫酸在160 ℃下處理30 min后的甘蔗渣在相同酶解條件下的聚糖轉化率僅為50%左右。

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Fractionating pretreatment of sugarcane bagasse for increasing the enzymatic digestibility of cellulose

Xuebing Zhao, and Dehua Liu
Institute of Applied Chemistry, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China

Received: November 20, 2010; Accepted: January 18, 2011

Supported by: International Cooperation Project of the Ministry of Science and Technology of China (No. 2010DFB40170), Tsinghua Research Funding (No. 2009THZ0223), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB707406).

Corresponding author: Xuebing Zhao. Tel/Fax: +86-10-62772130; E-mail: zhaoxb04@mails.tsinghua.edu.cn

科技部國際合作項目 (No. 2010DFB40170)，清華自主研發項目 (No. 2009THZ0223)，國家重點基礎研究發展計劃 (973計劃) (No. 2011CB707406)資助。