Paraquat聯合Maneb暴露對C57BL/6小鼠黑質酪氨酸羥化酶與α-突觸核蛋白的影響

李宏偉,周 波,文 敏,焦 玲,張春林

(貴陽醫學院 1.人體解剖學教研室;2.附屬醫院神經內科;3.生物學教研室,貴州 貴陽550004)

帕金森病(Parkinson's disease)是最為常見的神經退行性疾病,在65歲以上人群發病率約為1-3%,僅次于阿爾茨海默病[1,2]。其主要的神經病理學特征是黑質致密部多巴胺神經元進行性退化以及胞漿內路易小體(Lewy body)形成[3,4]。路易小體的主要成分是大量聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein),α-突觸核蛋白的過表達與PD發病密切相關[5]。本實驗運用慢性百草枯聯合代森錳暴露小鼠建立PD模型,通過檢測小鼠運動活性、黑質酪氨酸羥化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)陽性神經元數量和α-synuclein的表達水平,探討百草枯聯合代森錳致帕金森病的可靠性。

1 材料與方法

1.1 模型建立與分組

健康雄性C57BL/6小鼠30只,鼠齡7周,體重24-26克,由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供。小鼠飼養于貴陽醫學院動物實驗中心,室溫維持在18±2℃,濕度維持在50±10%,12/12光暗周期,自由進食和飲水。實驗開始前先給予適應環境一周。小鼠隨機分為正常對照組(10只)和、PQ+Mn染毒組(20只)。模型組給予百草枯(PQ,praquat,1,1'-dimethyl-4,4'bipyridinium,10mg/kg,Sigma公司)和代森錳(Mn,maneb,30 mg/kg,Sigma公司),溶于生理鹽水后腹腔注射,每周二、四早上各一次,連續6周;對照組在同一時間給予同等劑量的生理鹽水。

1.2 爬桿實驗

爬桿實驗用于檢測小鼠肢體運動協調性,以判斷小鼠運動行為異常的程度,于最后一次給藥后的第7天測試。測試方法如下:自制直徑為1 cm,高60 cm的直木桿,桿頂部有一橡膠球,木桿固定于木制底座上。木桿纏上紗布以防打滑。將小鼠頭向下放置,后爪抓住橡膠球,記錄動物從開始向下爬到前爪著地所用的時間,如遇小鼠中途停頓或轉身向上爬,則重新檢測,每只在記錄前訓練3次,訓練完畢后對其進行爬桿時間測定[6,7]。

1.3 標本采集

用3.6%的水合氯醛(1 ml/100 g體重)麻醉動物,在其左胸前壁縱行剪開心包,充分暴露心臟,經心包橫竇引過一絲線,繞主動脈及肺動脈根部打一松結,剪開左心室,將套管插入升主動脈中,結扎固定套管并立即開始灌注。先用生理鹽水50 ml(37℃)沖去血液,流速宜大,至右心室流出液體無色或略帶紅色,即可終止灌洗而改用固定液(4%多聚甲醛、飽和苦味酸、戊二醛)灌注,時間約30 min。灌注后開顱取腦,放入后固定液(4%多聚甲醛)中固定24小時。經脫水、常規石蠟包埋、冠狀連續切片,切片厚6 μ m,隔6取2,用于免疫組織化學染色。

1.4 TH和α-synuclein免疫組化(SABC法)

按試劑盒說明書操作。結果判定:以胞質中出現棕黃色顆粒為陽性神經元。

1.5 圖像分析

每只小鼠隨機選取5張切片,每張切片隨機選取4個視野,在同一視場面積,同一放大倍數,同一背景光強度下采集圖像,運用美國Mc公司Image-Pro Plus 6.0軟件統計TH陽性神經元數量以及測定α-synuclein陽性反應物積分光密度值。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 爬桿實驗

爬桿實驗檢測顯示,PQ聯合Mn腹腔注射后,小鼠爬桿時間較正常對照組顯著延長(P＜0.05),見圖1,并出現旋轉下桿或因喪失握持能力直接從桿上滑下,無法爬桿的現象。

圖1 小鼠爬桿時間比較

2.2 TH免疫組織化學染色

TH免疫組織化學染色結果顯示(圖2):正常對照組小鼠在中腦腹側黑質致密部和腹側被蓋區可見許多TH陽性神經元(107.83±7.885),細胞多為錐體形和三角形,胞漿內棕色顆粒濃;模型組小鼠黑質致密部和腹側被蓋區TH陽性細胞顯著減少(36.17±4.082),較正常組減少約66.5%,胞漿內染色較為淺淡。

圖2 小鼠黑質TH免疫組織化學染色(SABC法,×100)

2.3 α-synuclein免疫組織化學染色

α-synuclein免疫組織化學染色結果顯示(圖3):與正常對照組相比,模型組小鼠黑質致密部α-synuclein積分光密度顯著增高(P＜0.05),表達水平明顯升高,但在胞漿中沒有觀察到路易小體。

圖3 小鼠黑質α-synuclein免疫組織化學染色(SABC法,×400)

3 討論

PD動物模型的建立對闡明其發病機制,發現藥物作用靶點,新藥研發與篩選,以及新藥評價與用藥方案的確定具有重要意義。目前,常用的PD神經毒素模型包括 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)、魚藤酮、6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)等,這些模型雖能模擬出PD的臨床癥狀與病理改變,但多為非自然產生的神經毒素,與我國患者實際病因不符。PQ是世界上最為常用的除草劑之一,由于其化學結構與MPTP的活性物質MPP+極為相似,可引起人類及動物產生帕金森病,自2007年起已經被美國等13個國家禁用,但在我國仍廣泛使用[8,9]。Mn是一種除真菌劑,與PQ的使用存在地域上的重疊,能夠加劇多巴胺神經元的丟失和運動障礙[10,11]。因此,聯合PQ與Mn建立小鼠PD模型,既符合我國國情,又符合PD多環境因素致病的學說。

本實驗研究結果顯示,慢性暴露于百草枯和代森錳,使C57BL/6小鼠的運動能力減弱,黑質致密部多巴胺能神經元數量顯著降低,α-synuclein過度表達,這與 Chen等在其它動物模型研究結果一致[12,13]。α-synuclein過度表達可能是引起多巴胺神經元死亡的主要原因:(1)α-synuclein過表達導致活性氧(ROS)的增加,通過脂質過氧化、DNA損傷,抑制線粒體呼吸鏈的活性,引起細胞死亡[14,15]。(2)αsynuclein過表達能激活小膠質細胞和產生硝化應激,引起細胞死亡[16,17]。可見,增強對α-synuclein的清除將成為帕金森病治療的新策略。

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