左旋芹菜甲素注射液對大鼠局灶性腦缺血損傷的影響

朱 輝,吳曉冬,楊紹娟

(1.吉林大學第一醫院神經內科,吉林長春130021;2.吉林大學中日聯誼醫院中心研究室,吉林長春130033)

缺血性腦血管病是嚴重威脅人類健康的常見病和多發病,其發病率在不斷增高[1],病理過程涉及復雜的機制,目前有效的治療手段仍然缺乏。左旋芹菜甲素注射液(dl-3-n-butylphthalide,NBP)是從芹菜籽中提取的左旋芹菜甲素,對急性缺血性腦卒中患者的中樞神經功能的損傷有改善作用,可促進患者功能恢復,其口服藥恩必普已經問世,是我國腦血管治療領域的第一個擁有自主知識產權的國家一類新藥,但是其注射液目前還沒有應用于臨床。我們課題組對左旋芹菜甲素注射液對腦缺血的梗塞面積、神經功能恢復及凋亡的發生改變進行了進一步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性健康Wistar大鼠,體重280-320 g,共60只。隨機分為對照組和左旋芹菜甲素注射液治療組,制備成大鼠大腦中動脈阻斷局灶性腦梗塞動物模型(MCAo),在MCAo術后半小時尾靜脈注射左旋芹菜甲素注射液(20 mg/kg),共注射七天,對照組注射同體積的生理鹽水。第一天處死20只,第四天處死20只,第七天處死20只。

1.2 實驗試劑 左旋芹菜甲素注射液(恩必普藥業提供);RT-PCR試劑盒(TAKARA);引物合成(上海生物工程公司);4%福爾馬林固定液(Promega);0.01PBS(Promega)。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠大腦中動脈阻斷局灶性腦梗塞動物模型的制備 本實驗動物在手術前8-12小時禁食,參照Koixumi[2]和Longa[3]發明的腔內線栓法制備大鼠左側大腦中動脈局灶性腦梗塞動物模型(MCAo),插入尼龍線1小時。拔出后半小時大鼠尾靜脈注射左旋芹菜甲素注射液,濃度為20 mg/kg,對照組注射同體積的生理鹽水,回籠飼養。

1.3.2 神經功能缺失評分 我們采用16分制[4]的神經功能評分方法對大鼠的神經功能進行評定。0分為正常,1-4分為輕度損傷,5-9分為中度損傷,10分以上為重度損傷。

1.3.3 處死各組動物 用水合氯醛腹腔注射,待對疼痛刺激無反應時,自中線剪開腹腔及胸腔,暴露心臟,用套管針穿刺左心室,拔出針芯,將管頭置于升主動脈開口處,剪開右心耳,從導管內快速注入冰PBS緩沖液,待肝臟顏色變白后,改用4%福爾馬林PBS固定液灌注。用咬骨鉗咬開顱骨,取出腦標本。

1.3.4 梗塞面積測定 選擇視交叉水平的腦組織切片,HE染色后利用圖象分析儀測定損傷面積、同側半球面積和對側半球面積。用損傷面積/同側半球面積×100%,表示梗塞面積程度。

1.3.5 Caspase3的表達 按 RT-PCR試劑盒說明書,對處死動物取新鮮的腦組織,提取mRNA,經過RT-PCR檢測Caspase3的表達。Caspsae3引物序列上游:5′-TGC GGC GTT ACA CGA CCT T-3′;下游 :5′-CAA AGC CAG TGG CAC TCA TTC TC-3′產物長度200 bp;β-actin 上游 :5′-GAA ACT ACC TTC AAC TCC ATC-3′;下游 5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′產物長度300 bp。以120V電壓電泳30分鐘,在凝膠成像系統下觀察,擴增產物進行面積灰度掃描,以灰度代替表達量;靶基因灰度/β-actin灰度,即為靶基因mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 神經功能缺損評分 我們采用16分制的神經功能缺損評分方法評定結果顯示,左旋芹菜甲素注射液治療組和對照組比較在手術后四天開始有顯著差異,用藥組恢復明顯增快(P＜0.05)(見表1)。

2.2 病理學檢查 HE染色后利用圖象分析儀測定損傷面積,在術后四天、七天左旋芹菜甲素治療組和對照組損傷面積差異顯著(P＜0.05)(見表2)。

表1 神經功能缺損評分結果

表2 梗塞面積測定

2.3 Caspase 3表達 在第四天和第七天組有Caspase3表達量的減少(P＜0.05)(見表3)

表3 Caspase3 mRNA相對含量表達(灰度值)

3 討論

腦缺血再灌注后腦損傷的發病機制較復雜,有多個病理環節參與,是一個多基因和多靶點參與的過程。與自由基的生成、炎癥反應、Caspase-3的表達、細胞內鈣超載、興奮性氨基酸毒性、基因活化、線粒體功能障礙等很多因素有關[5]。目前在國內外有關腦缺血的治療方法其效果都還不理想。

從安全性角度講,左旋芹菜甲素注射液源于天然植物,安全性很好,副反應低;在缺血性腦卒中的各個治療階段都可以使用,突破了溶栓藥物6個小時的治療”時間窗”限制。我們通過靜脈給予左旋芹菜甲素注射液,探討左旋芹菜甲素注射液在大鼠局灶性腦缺血腦組織中對細胞凋亡的研究,及對神經功能恢復和梗塞面積的影響。

我們首先制備了缺血性腦血管病的動物實驗模型,采用Koizumi[2]和Longa[3]發明的腔內線栓法來制作大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO),該模型不需開顱,對全身影響小,重復性好,缺血部位恒定,較好地模擬了臨床腦梗塞的發病過程。另外由于神經功能缺損評定是一個重要的判定腦保護的指標,所以我們采用16分制的神經功能評定標準對大鼠的神經功能進行評定,從MCAo手術后4小時開始,每天一次。結果表明在術后第四天開始,對照組和用藥組之間開始出現有統計學意義的顯著差異,說明對于局灶性腦缺血大鼠,用藥組的神經功能缺損恢復的速度快而且完全,提示我們左旋芹菜甲素注射液在急性缺血性腦血管病中具有神經保護作用。

選擇視交叉水平的腦組織切片,HE染色顯示左旋芹菜甲素注射液治療組在第四天即有損傷面積的明顯縮小,且梗死灶周邊區域細胞形態變化較輕。到第七天更明顯,由此說明左旋芹菜甲素注射液也能顯著減少梗塞的面積,這也可能是神經功能恢復比對照組快的原因之一。

Caspase對神經元凋亡的發生起關鍵作用。已經明確凋亡存在著三條細胞信號傳導途徑[5,6]:死亡受體途徑、線粒體途徑及其內質網途徑。最經典的是細胞內外各種死亡信號誘導線粒體釋放Cytoc,再與Apaf-1和procaspase-9結合,形成Cyto-c Apaf-1 procaspase-9即”凋亡小體”(apoptosome),使 procaspase-9活化并激活下游的caspase3。但無論哪一條途徑都有caspase3的密切參與。我們也同樣檢測到用左旋芹菜甲素注射液治療后,第四天和第七天都有caspase3表達下降,表明左旋芹菜甲素注射液通過下調Caspase3的表達,引起大鼠局灶性腦缺血后神經元細胞凋亡的減少。最近國內也有人報道左旋芹菜甲素能夠通過抑制細胞色素-C的釋放[7],下調Caspase8的表達來抑制凋亡,保護神經元,與我們的實驗結果是相吻合的,另外caspase 3的抑制劑可顯著抑制缺血易損區caspase 3的活性、阻止PARP的裂解,從而抑制神經元凋亡改善神經功能[5]。Caspase的抑制劑Z-VAD-fmk可以促進神經功能恢復,減少梗塞發生[8]。這些都說明Caspase在腦缺血的神經細胞凋亡中起到重要作用。

我們通過靜脈給予左旋芹菜甲素注射液,可以減少大鼠局灶性腦缺血腦組織中細胞凋亡,加快神經功能恢復,并且減少梗塞面積,也由此說明左旋芹菜甲素注射液不但通過口服,靜脈也可以達到所需效果,成為急性缺血性腦梗死的臨床治療的又一有效手段。

[1]李 惠.缺血性腦血管疾病[M].北京:北京科學技術出版社,2002,47-57.

[2]Koizumi JY,Nakazawa TO,Ooneda G.Experimental studies of ischemic brain edema:a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J Stroke,1986,8:1.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20:84.

[4]Gelmers HJ.Calcium-channel blockers:effects on cerebral blood flow and potential uses for acute stroke[J].Am J Cardiol,1985,55(3):144B.

[5]Tanaka H,Yokota H,Jover T,et al.Ischemic preconditioning:neuronal survival in the face of caspase-3 activation[J].J Neurosci,2004,11:2750.

[6]Chen J,Nagayama T,Mitsumoto Y,et al.Induction of caspase-3-like protease may mediate delayed neuronal death in the hippocampus after transient cerebral ischemia[J].J Neurosci,1998,18(13):4914.

[7]王建華,劉瑞珍.丁苯酞對大鼠腦缺血再灌注損傷后細胞色素-C的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志,2010,8:320.

[8]朱 輝,吳曉冬,吉田泰二.延遲注射Z-VAD-fmk對局灶性腦缺血神經功能及梗塞面積的影響[J].中風與神經疾病雜志,2009,26(2):149.