糖尿病大鼠蛋白尿與腎臟病理及nephrin表達的相關性研究

屈智慧,楊立志,趙 穎,肖慶飛,崔明姬

(吉林大學第一醫院腎內科,吉林長春130021)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病慢性微血管并發癥之一,是歐美國家導致終末期腎病的主要病因,其早期腎臟病理特征是腎臟肥大、基底膜增厚、細胞外基質增多。臨床早期表現為微量蛋白尿,繼之出現臨床蛋白尿,可致進展性腎功能損害。其早期臨床標志是白蛋白尿,而白蛋白尿的產生與一種近年來研究的足突裂孔蛋白nephrin表達減少有關。本研究觀察不同時期糖尿病大鼠尿白蛋白的排泄量與大鼠腎臟病理改變及Nephrin蛋白表達的相關系性,為進一步研究糖尿病腎病的發生發展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年清潔級雄性Wistar大鼠40只,購自北京實驗動物中心,體質量220±20 g,普通飼料喂養,隨意飲水,攝食,室溫控制在25℃左右,濕度55%,12小時交替照明。

1.2 動物模型制作與分組 按隨機數字表法將40只大鼠分為正常組(NC)與糖尿病模型組(DM),每組大鼠20只。造模前禁食12小時(不禁水),將鏈脲菌素(STZ)溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液,pH4.2,按50 mg/kg一次性腹腔內注射,每日監測尿糖,3天后采尾靜脈血測血糖濃度大于16.7 mmol/L,尿糖陽性,確定為糖尿病模型形成。正常組給予等體積的枸櫞酸緩沖液一次性腹腔注射。

1.3 標本的采集 分別于0周、4周、8周、12周(各周均指造模成功后的各周末)從NC組與DM組各隨機取大鼠5只處死,處死前稱體重后置入代謝籠中收集24小時尿液,計尿液總量后取10ml離心,取上清液于-20℃冰箱保存待測。留尿后用乙醚麻醉大鼠,剪尾測血糖,摘眼球取血,離心后取血清-20℃冰箱保存,用于血肌酐、尿素氮的檢測。取血后頸椎離斷處死大鼠,迅速取出腎臟,右腎去除包膜,生理鹽水洗去血跡后稱重,用于計算腎重/體重指數(KW/BW)。左腎縱向切開,部分標本用4%多聚甲醛固定48小時,常規制備石蠟切片。連續切片厚3-4 μ m,做常規HE染色與PAS染色,以及免疫組化染色,光鏡觀察。

1.4 指標的檢測 免疫比濁法檢測24 h尿白蛋白量。采用Beckman全自動生化儀測定大鼠血尿素氮(BUN),血肌酐(Scr),尿肌酐(Ucr),計算內生肌酐清除率(Ccr),Ccr(ml/min.kg)=Ucr(mg/dl)x每分鐘尿量(ml/min)/Scr(mg/dl)/體重(kg)。

1.5 腎組織病理檢查 標本用4%多聚甲醛固定48 h,乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋切片,連續切片厚3-4 μ m,PAS染色光鏡觀察。

1.6 腎組織nephrin蛋白免疫組化表達 首先采用SP法,石蠟切片脫蠟水化后,微波修復抗原,3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶活性,PBS洗滌,正常血清封閉非特異性抗原,依次加入一抗山羊抗鼠nephrin多克隆抗體(1∶100,美國Santa Cruz),二抗為滴加生物素化兔抗山羊IgG二抗(福州邁新),DAB顯色,蘇木精復染,封片,鏡檢。以PBS代替一抗作陰性對照染色。采用HMIAS2000高清晰度彩色圖文分析系統,在高倍鏡下每張切片隨機選取10個完整腎小球,以胞質出現棕黃色顆粒為陽性信號,分別測量出每個腎小球陽性區面積、陽性區積分光密度,二者相除后得陽性區平均積分光密度值(IOD),再取IOD均值進行免疫組化的半定量分析,代表樣本相對陽性表達量。

2 結果

2.1 兩組大鼠不同時期體重、腎重/體重指數、24小時尿白蛋白及肌酐清除率(Ccr)的變化

0周時兩組大鼠體重無差異,實驗期間NC組體重較DM組增長迅速,4周起兩組體重在各周比較差異有統計學意義(P＜0.05);DM組大鼠腎重/體重指數第4周起,與NC組比較均有增加差異有統計學意義(P＜0.05);DM組4周后尿白蛋白開始增加,與同期NC組比較差異有統計學意義(P＜0.05),至12周時,DM組尿白蛋白與同期NC組比較差異更加明顯(P＜0.01);0周時兩組大鼠肌酐清除率無差異,第8周時DM組大鼠肌酐清除率增高明顯,與同期NC組比較差異有統計學意義(P＜0.05),但12周時DM組大鼠肌酐清除率較8周時有所下降,考慮與腎臟損傷加重有關。(見表1)。

表1 兩組大鼠不同時期體重、腎重/體重指數、尿白蛋白及肌酐清除率(Ccr)的變化(±s)

表1 兩組大鼠不同時期體重、腎重/體重指數、尿白蛋白及肌酐清除率(Ccr)的變化(±s)

注:與同期NC組比較,*P＜0.05,▲P＜0.01

組別 時間(W) 鼠數(n) 體重(g) 腎重/體重指數(‰) 尿白蛋白(mg/24 h) Ccr(ml?min-1100 g-1)NC組 0 5 223.2±15.6 3.67±0.22 4.37±0.53 0.67±0.15 4 5 275.3±18.2 3.44±0.26 4.72±1.01 0.68±0.20 8 5 311.7±24.9 3.81±0.37 5.65±0.73 0.66±0.17 12 5 373.4±38.2 4.22±0.32 6.46±1.84 0.70±0.23 DM組 0 5 226.1±12.7 3.52±0.20 4.16±0.72 0.71±0.14 4 5 247.6±13.5* 5.07±0.29* 7.28±1.76* 0.74±0.18 8 5 278.3±20.4* 5.99±0.61* 9.77±2.11* 0.98±0.21*12 5 297.4±53.2* 7.58±1.03* 15.98±2.49▲ 0.83±0.38

2.2 腎組織病理光鏡檢查結果

光鏡PAS染色顯示,整個實驗過程中NC組大鼠腎臟組織均未見明顯病理學改變。DM組第4周末時,較NC組及本組0周比較腎小球體積增大,系膜區輕度增寬,第8周末腎小球系膜基質增多,系膜細胞明顯增多,基底膜增厚,第12周伴有基底膜彌漫增厚,毛細血管塌陷明顯。(見圖1)。

2.3 腎組織nephrin蛋白的表達

NC組不同時間大鼠腎組織nephrin表達均勻分布于腎小球毛細血管袢,可見棕黃色的nephrin沿基膜呈線形分布。DM組大鼠腎組織nephrin表達從第8周開始不如0周及4周均勻,染色強度減弱,棕黃色線樣沉積逐漸變細、變淡,第12周時褪色更加明顯。同時測定陽性區腎組織nephrin蛋白的表達量DM組大鼠第8周時較0周、4周降低,第12周時降低更加明顯,差異有統計學意義(P＜0.05,P＜0.01),而NC組大鼠不同時期均無變化。(見圖2,表3)。

表3 兩組大鼠不同時期腎小球nephrin蛋白免疫組化表達量的比較(±s)

表3 兩組大鼠不同時期腎小球nephrin蛋白免疫組化表達量的比較(±s)

注:與本組0周比較,*P＜0.05,▲P＜0.01;

組別 0周 4周 8周 12周NC組 35.26±1.73 37.01±2.11 34.88±2.24 38.47±2.59 DM 組 36.55±1.62 31.79±2.03 24.10±1.85*20.21±1.96▲

3 討論

近年來隨著糖尿病發病率的逐漸增高,對糖尿病腎病的研究也倍受重視,尤其是糖尿病腎病早期白蛋白尿的產生與作用機制。Lin等[1]研究證明DN蛋白尿進展的兩個關鍵因素是足細胞數量的減少及足細胞裂孔蛋白 nephrin的減少。Nephrin蛋白是1998年瑞典教授Karl Tryggvason在研究先天性腎病綜合征芬蘭型時發現的,它是腎小球濾過屏障上皮細胞足突之間裂孔隔膜上第一個被確定的蛋白[2-3]。其在足突裂孔膜處形成“拉鏈樣結構”,它的缺失或氨基酸序列的改變,會導致裂孔膜的破壞,進而產生大量尿蛋白[4]。

糖尿病不同時期蛋白尿的排泄量及其與nephrin蛋白表達異常關系的研究結果也不盡相同。Doublier等[5]證實糖尿病早期腎小球nephrin蛋白減少,說明nephrin是糖尿病早期腎臟損傷的標志物。Aaltonen[6]等利用PCR檢測STZ誘導的糖尿病大鼠腎組織中nephrin mRNA的表達,顯示第4周nephrin mRNA平均上調50%,這種趨勢一直持續到16周。Bonnet[7]用RT-PCR與免疫組化的方法研究糖尿病自發高血壓小鼠,結果發現,隨著蛋白尿的出現,腎組織中nephrin mRNA的含量減少,免疫組化染色亦減退。

本研究中發現,DM組第4周時尿白蛋白排泄量開始增加,大鼠腎重/體重指數同步增加,而肌酐清除率第8周時有明顯增高,說明尿白蛋白的改變早于腎功能的改變,白蛋白尿是糖尿病早期腎損害的標志。肌酐清除率第12周時有所下降,說明隨著糖尿病病程的延長,尿蛋白排泄率不斷增加導致腎臟損傷加重。腎組織病理光鏡結果發現第4周時只有腎小球體積增大,系膜區輕度增寬,第8周時腎小球系膜基質增多,系膜細胞明顯增多,基底膜增厚,待第12周時出現基底膜彌漫增厚,毛細血管塌陷明顯。DM組大鼠腎組織nephrin表達從第8周開始不如0周及4周均勻,染色強度減弱,棕黃色線樣沉積逐漸變細、變淡,第12周時褪色更加明顯。同時測定陽性區腎組織nephrin蛋白的表達量DM組大鼠第8周時較0周、4周降低,第12周時降低更加明顯,而NC組大鼠不同時期均無此變化。說明糖尿病腎病臨床早期出現微量蛋白尿,繼之出現臨床蛋白尿,最終進展至腎功能損害,這一系列改變與足細胞裂孔蛋白nephrin的表達有相關性。

總之,我們認為糖尿病大鼠隨著糖尿病病程的延長,尿蛋白排泄率不斷增加與腎臟病理損傷的嚴重程度有關,且與腎組織nephrin的表達相關,足細胞裂孔蛋白nephrin是糖尿病腎損傷的早期標志。應該更加深入定量研究nephrin蛋白在糖尿病不同時期的作用,為降低糖尿病腎病的發生率開辟一個新的道路。

[1]Lin CL,Wang FS,Hsu YC,et al.Modulation of Notch-1 signaling alleviates VEGF-mediated diabetic nephropathy[J].Diabetes,2010,59:1561.

[2]Tryggvason,K.Unraveling the mechanisms of glomerular ultrafiltration:nephrin,a key component of the slit diaphragm[J].J Am Soc Nephrol,1999,10:2440.

[3]Wickelgren I.First component found for new kidney filter[J].Science,1999,286:225.

[4]Welsh GI,Saleem MA.Nephrin-signature molecule of the glomerular podocyte?[J].J Pathol,2010,220:328.

[5]Doublier S,Salvidio G,Lupia E,et al.Nephrin expression is reduced in human diabetic nephropathy:evidence for a distinct role for glycated albumin and angiotensin II[J].Diabete,2003,52:1023.

[6]Aaltonen P,Luimula P,Astrom E et al.Changes in the expreesion of nephringene and protein in experimental diabetic nephropathy[J].Lab Invest,2001,81:1185.

[7]Bonnet F,Cooper ME,Kawachi H,et al.Irbesartan normalises the deficiency in glomerular nephrin expression in a model of diabetes and hypertension[J].Diabetologia,2001,44(7):874.