利用熒光共振能量轉移方法研究Snap23和Munc 18C在CHO細胞中的相互作用

趙 岳,宋 瑩,徐凱成*,趙吉生

(1.吉林大學中日聯誼醫院,吉林 長春130033;2.吉林大學第二醫院)

囊泡相關膜蛋白synaptobrevin/VAMP和syntaxin相互作用調節細胞內特異性囊泡運輸[1,2]。synaptobrevin/VAMP與突觸小體相關蛋白Snap25共同形成復合體[3,4],Snap25主要存在于腦組織,其同源體廣泛分布于于各個組織。其中Snap23的結構和功能與Snap25相似,分子量為23 KD,與多種syntaxins/VAMPS緊密結合,參與囊泡的定向靶向和囊泡與細胞膜的融合過程。Snap23可與許多蛋白相互作用。本研究應用熒光共振能量轉移的方法,檢測snap23與Munc 18c是否有相互作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pEYFP-N1質粒購自Clontech,RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自QIAGEN;PECFPMunc 18c由德國惠贈。XhoⅠ和KpnⅠ內切酶、小規模質粒提取試劑盒、PCR純化劑盒購自TAKARA。PfuTaq酶、Lipofectamine Plus Reagent購自 ROCHE。GFP抗體購買自Santa Cruz公司。PCR引物合成及DNA測序由TAKARA公司完成。胎牛血清、IMDM培養基購自HYCLONE。CHO細胞購買自中科院上海細胞所,DH5α菌由本院中心實驗室保存。

1.2 Snap23基因的擴增 自人肌肉組織中提取總RNA逆轉錄為cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列如下:Senseprimer:5'-GGGCTCGAGATGGATAATCTGTCATCAGAAG,Antisense primer:5'-GGGGACGTCTTAGCTGTCAATGAGTTTCTT。反應條件如下 :50 μ l 反 應體 系,cDNA 模板 2 μ l,dNTP(2.5 μ mol/l)5 μ l,引物(20 μ mol/l)各 1 μ l,pfuTaq 酶(5 ×106U/L)0.5 μ l,10×Pfu buffer 5 μ l,其余用水補足 。熱循環程序:預變性95℃5min,94℃變性1min,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,總35個循環,最后一次72℃延伸10 min。PCR產物進行瓊脂糖電泳分析。

1.3 pEYFP-Snap23載體克隆與鑒定 PCR產物切膠回收后進行雙酶切,反應體系如下:XhoⅠ 1 μ l,KpnⅠ 1 μ l,10×buffer 4 μ l,PCR 產物34 μ l,37℃下酶切5小時;34 μ L pEYFP-N1載體(240 ng/ul)在相同條件下進行酶切,分別回收目的基因片段及線性化載體片段并用T4DNA酶連接16 h,轉入DH5a感受態細胞,37℃培養過夜后在LB板(100 g/l氨芐)上挑取8個陽性克隆分別加入3 mL LB培養基中(100 g/l卡那)37℃水浴250RPM 震蕩16 h,提取質粒酶切鑒定分析,選取4個克隆測序。

1.4 pEYFP-Snap23質粒轉染CHO細胞 CHO細胞培養 含有10%胎牛血清的IMDM培養基,37℃5%CO2培養箱中培養,傳代次數控制在30代之內,質粒轉染:轉染前日將細胞接種于六孔培養板中,每孔細胞約2×104。當融合率達70-80%時,更換無血清培養基,取 pEYFP-Snap23 質粒約 1 μ g,經 Lipofectamine plus regent作用3 h,加入10%胎牛血清培養,同時轉染PEYFP-N1質粒作為陰性對照。

1.5 熒光觀察免疫印跡鑒定 質粒轉染48 h后熒光顯微鏡下觀察并拍照后,細胞提取總蛋白進行免疫蛋白印跡分析。具體過程:冰上收集細胞,加入100 μ L RIPA 裂 解液 (10 mM NaPO4pH 7.4,0.3 M NaCl,0.1%SDS,1%NP-40,1%DOC,2 mM EDTA,2 mM PMSF),4℃震蕩裂解30 min后,15 000 g離心30 min回收上清液并檢測蛋白濃度后,總上樣量50 μ g行SDS-PAGE電泳,轉膜后5%脫脂牛奶封閉1 h,加入鼠抗人GFP抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,洗脫后加入羊抗鼠IgG(1∶1 000)孵育1 h,TBST洗滌后掃描并拍照。

1.6 熒光共振能量轉移

1.6.1 pECFP-Munc 18c和 pEYFP-Snap23共轉染CHO細胞。CHO細胞接種于6孔培養板,pECFPMunc 18c和PEYFP-Snap23共轉染48h后接種于多聚賴氨酸包被過夜的培養玻片上。

1.6.2 選擇性受體漂白熒光共振能量轉移條件YFP excitation:514 nm;Emission,545/40 nm;CFP:Excitation,457 nm;Emission,485/30 nm。

2 結果

2.1 以Snap23特異性引物進行PCR擴增后,電泳圖譜顯示在0.7 kb處見到有一處特異性很強的條帶,見圖1。

圖1 人Snap23 PCR結果

2.2 在pEGFP-snap23 LB培養板上選取轉化后8個陽性克隆進行酶切鑒定,經XhoⅠ和KPNⅠ雙酶切后,可見克隆2,3,4,5,6出現0.7 KB的特異性DNA片段。選取2,3,4,5克隆經寶泰克公司自動測序儀進行序列分析,證明所獲得的cDNA片段與genebank序列完全符合,見圖2。

2.3 利用脂質體法將PEYFP-SNAP23轉染至CHO細胞中,熒光顯微鏡下可見明顯熒光,可見Snap23蛋白是一種可溶性蛋白,主要表達細胞核以外的細胞質上。轉染PEYFP-N1質粒作為對照,可見EYFP蛋白分布在包括細胞核在內的整個細胞上,見圖3。

2.4 利用western-blot方法鑒定pEYFP-Snap23在CHO細胞中的表達,Western結果顯示pEYFP-Snap23成功表達,見圖4。

2.5 熒光共振能量轉移結果表明,Munc 18c和snap25存在相互作用,FRET為15.87%+0.5562(N=89),較對照組(ECFP-與YFP-N1)FRET(5.8%+0.082)明顯增高,有統計學意義,見圖5。

圖2 XhoⅠ和KpNⅠ酶切鑒定 pEGP-Snap23

圖3 A PEYFP-Snap23轉染至CHO細胞中

圖3 B pEYFP-N1轉染至CHO細胞中

圖4 免疫蛋白即跡檢測pEYFP-Snap23蛋白表達

圖5 CFP-Munc 18c和YFP-Snap23熒光共振能量轉移結果

3 討論

囊泡轉運在細胞內成分和信息交換過程中起到重要作用,在轉運過程中,而囊泡與質膜融合的胞吐過程是由可溶性N-乙基-敏感因子連接物復合體(Soluble N-ethyl-maleimide-sensitive fusion factor attachment protein receptor,SNARE)。SNAREs是一個多功能的蛋白家族,根據亞細胞定位不同,分為囊泡上的VSNARE和質膜上的T-SNARE,V-SNARE和T-SNARE形成復合體,共通催化膜融合。Snap23是T-SNAER的亞類蛋白,表達于多種組織,在非神經細胞的胞吐中起重要作用。已有研究證明:snap23蛋白和多種蛋白有相互作用,包括 STX2,NAPA,KIF5B,STX6,SYBL1,VMP3,STX4等[5]。近些年發現,SNARE蛋白間的結合也可能通過其他蛋白,如Rab,munc18,SNIP和synip[6]進行調節。Munc 18是一種在調節囊泡錨定,融合和胞吐作用中扮演重要角色的蛋白質。哺乳動物Munc 18蛋白由三種亞類組成,分別是Munc 18a,Munc18b和Munc 18c[7],有研究表明Munc 18C與STX4結合從而抑制囊泡錨定與融合。本研究通過熒光共振能量轉移明確Munc 18C是否可以與Snap23蛋白有相互作用。

熒光共振能量轉移是近些年發展起來的新技術,是研究蛋白質相互作用的有力武器。其基本原理是:當供體熒光分子受到激發時,其發射光譜與受體熒光分子的激發光譜有重疊部分,并且二者距離很近(＜10 nm)時,受體可被供體所激發,熒光增強[8]。在本實驗中,我們以CFP和YFP作為配對來研究Munc 18C和Snap23之間有無相互作用。結果證明,當CFP-Munc 18C被激發時,可以將能量傳遞給YFP-Snap23,即發生FRET,證明二者之間可能存在相互作用,但是相互作用的機制以及其影響因素還需進一步研究。

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