發光二極管熒光顯微鏡檢測結核分枝桿菌的臨床應用評價

邵燕 朱永東 陶友愛 彭紅 李國莉 陳誠 許衛國

根據世界衛生組織2009年全球結核病報告顯示，中國是全球第二位的結核病高負擔國家。目前，我國結核患者的發現主要依靠基層醫療機構的痰涂片鏡檢技術。由于萋－尼（Ziehl－Neelsen，Z－N）染色和普通光學顯微鏡鏡檢具有操作簡單、特異度較高、價格低廉等優點，雖然已有百余年的歷史，但仍是目前我國基層實驗室診斷結核病的主要方法。但大量的研究也表明Z－N染色的痰涂片檢測肺結核的敏感度波動范圍較大，達20%～80%［1－3]，而金銨 O 或羅丹明熒光染色的痰涂片經傳統熒光顯微鏡（fluorescence microscopy，FM）檢測，其敏感度平均可提高10%［4－5]。但傳統熒光顯微鏡的檢測成本過高，不適用于發展中國家。發光二極管熒光顯微鏡（light－emitting diodes，LED）很好地解決了該問題，同時相對于普通光學顯微鏡具有觀察時間短、應用良好等優點。

因此，中國衛生部－蓋茨基金會結核病防治合作項目（簡稱“中蓋結核病項目”）結核病新診斷工具可行性子項目將LED技術引入我國結核病基層實驗室進行臨床應用研究，江蘇省淮安市淮陰區參加了該項目的實施。為探討LED在基層臨床應用效果，筆者對淮陰區驗證階段的有關數據進行了統計和分析。

資料和方法

一、實驗器材

項目實施中，傳統光學顯微鏡（conventional microscopy，CM）為奧林巴斯 CX21FS1－2；FM 為蔡司Imager A1，所用物鏡為20×；LED為蔡司Primo Star iLED，所用物鏡為20×。

二、研究對象

項目驗證階段（2009年12月21日至2010年5月7日）淮陰區所有痰涂片，包括Z－N染色涂片和熒光染色涂片，分別為1941張和1940張。

三、驗證設計

本項目共包括預試驗、驗證階段及示范階段3個部分。項目點檢驗人員在培訓后經3周預試驗熟悉熒光染色操作流程和LED的使用方法。此階段結束前由省級對項目點進行質量評估和批量測試，合格后進入下一階段。驗證階段為12周，凡是該階段初診和隨訪結核患者均為納入對象，每份痰標本涂2張玻片，分別進行Z－N染色和熒光染色。項目點的2名實驗室人員分別用普通光學顯微鏡和LED顯微鏡進行讀片并報告結果，每2周輪換1次。此外，每2周由省疾病預防控制中心結核病實驗室（以下簡稱省級結核病實驗室）對項目點的所有涂片進行復核，其中復核熒光染色涂片時省級結核病實驗室使用的是傳統熒光顯微鏡。所有涂片的最終結果以省級結核病實驗室復核為準。

四、實驗方法

（1）涂片染色及鏡檢：①Z－N染色：涂片自然干燥后，0.8%石碳酸復紅加熱染色，直至出現蒸汽，保持染色5min；流水輕緩沖洗，5%鹽酸乙醇脫色1min，流水沖洗；亞甲藍復染30s。②熒光染色：0.1%金銨O染色30min；流水輕緩沖洗，5%鹽酸乙醇脫色3min；最后滴加0.5%高錳酸鉀染色1min。（2）讀片：Z－N染色涂片經10×目鏡及40×物鏡調節焦距，100×油鏡讀片；熒光染色涂片經20×物鏡讀片。

以上詳細的操作步驟和判讀標準均按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》［6]進行。

五、資料的統計學處理

運用增強配對卡方檢驗（McNemar－Bowker test）對多分類計數配對資料進行統計學處理，2組實驗的一致性比較使用Kappa檢驗（Kappa值在0.75以上為較強，0.4～0.75為一般，0.4以下為較弱。利用SPSS 11.5軟件進行統計分析，P＜0.05認為有統計學意義。

結 果

驗證階段淮陰區完成3882張涂片，包括Z－N染色和熒光染色，經省級復核3881張涂片（其中1張熒光涂片由于運輸后破損，未能復檢）。復檢后，Z－N染色涂片陽性片284張，陽性率（Z－N染色陽性涂片數／Z－N染色總涂片數）為14.6%，低假陽性4張，低假陰性9張，符合率99.3%；熒光染色涂片中陽性片464張，陽性率23.9%（熒光染色陽性涂片數／熒光染色涂片總數），低假陽性39張，低假陰性6張，符合率97.6%（表1）。

在所有的痰涂片中，至少1種方法判讀為陽性的共511張，其中LED陽性為498張，其中有1張LED陽性片因破損未能經FM復核，FM陽性464張，而Z－N染色僅284張陽性。LED和FM不一致的共46張，6張FM陽性而LED陰性，39張FM陰性、LED陽性，1張FM 1＋而LED 3＋；LED和Z－N染色不一致的共268張，其中Z－N染色陰性、LED陽性的有220張（表2，3）。經 McNemar－Bowker test檢驗，差異均有統計學意義。LED和FM比較Kappa 值 為 0.903，LED 和 ZN 的 Kappa 值為0.409。

表1 淮陰區驗證階段不同檢測方法痰涂片檢測結果（張）

為了比較Z－N染色和LED在發現結核患者及患者隨訪過程中的差異，運用回顧性研究統計了該階段部分患者的臨床診斷結果，分析其與Z－N染色及LED之間的關系。結果顯示，對78例新發涂陽患者，2種方法的檢查結果一致，均為陽性；而在113例涂陰患者中，Z－N染色均為陰性，LED則檢出了14例陽性；另外，378例涂陽隨訪患者中有33例Z－N染色為陰性，而LED檢出為陽性（表4）。

討 論

目前我國基層結核病實驗室發現患者主要依靠Z－N染色CM鏡檢，但現有的研究表明，Z－N染色敏感度不高，陽性檢出率低；FM敏感度高于Z－N染色，但成本過高，不適用于我國基層實驗室；而新近的LED技術相對于Z－N染色和FM敏感度均有明顯提高。本研究也表明，熒光染色LED讀片陽性率比Z－N 染色提高近10%。經 McNemar－Bowker test檢驗，LED與Z－N染色及FM的比較差異均具有統計學意義（P＜0.001）。而 Kappa檢驗提示LED和FM 的一致性較高（Kappa＝0.903），LED和Z－N染色則一致性一般（Kappa＝0.409）。結合上述McNemar－Bowker test檢驗結果，說明LED在陽性率方面優于Z－N染色。

表2 FM與LED檢測結果比較（張）

表3 Z－N染色與LED檢測結果比較（張）

表4 臨床診斷結果與Z－N染色及LED比較（例）

此外，在本研究中淮陰區2名工作人員分別獨立完成了1941張Z－N染色片和1940張熒光染色片的鏡檢工作，經省級定期復檢后發現，Z－N染色和LED的符合率均達到了95%以上，但LED檢測的低假陽性誤判率高于Z－N染色。對于以上結果，筆者考慮可能相對于基層長期使用的Z－N染色鏡檢，檢驗人員對于熒光染色技術和LED顯微鏡的把握度比較低，區分雜質和菌體的能力還有待進一步提高。

進一步分別比較LED與Z－N染色和FM的差異，發現主要集中在定性區別上。其中，LED和FM符合度較高，均在1＋以內，這和 Mizuno等［7]的研究結果類似。而LED和Z－N染色的結果差別明顯，甚至存在1＋以上的差別。

此外，筆者比較了部分納入患者臨床診斷結果與Z－N染色及LED的關系，發現LED和Z－N染色在新發涂陽患者的檢測中無差別，但是對涂陰患者的檢測結果有較明顯不同，LED比Z－N染色多檢出了14例陽性。與此同時LED的隨訪陽性率也明顯高于Z－N染色。國內外很多研究都表明LED在敏感度和特異度方面明顯優于Z－N染色，特別是LED和金標準改良羅氏（L－J）培養符合率很高，假陽性率明顯低于Z－N染色［8－9]。這提示在患者發現及療效隨訪過程中，LED可以更有效地提高患者發現率及指導臨床治療。

通過此次研究，筆者還發現LED在基層實驗室應用過程中還有很多細節需要完善。特別是對于大部分檢驗人員而言，熒光染色LED鏡檢技術還是比較陌生的，經短期培訓后仍然存在讀片效果反而低于Z－N染色的問題。最近一項在印度的研究也表明，雖然在很多方面LED檢測相對于Z－N染色和FM有明顯優勢，但必須有足夠的培訓和標準化操作才能確保其最大限度的準確性［10]。因此，作為結核病診斷的新技術，LED具有很大的推廣價值，有利于我國的結核病發現和控制。但為了達到這一目標，需要對檢驗人員進行系統、充分的操作培訓，建立完善的標準化操作規程和質量保證體系，以幫助檢驗人員迅速適應并掌握該技術。

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