干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法在結(jié)核病診斷中的價(jià)值

劉佳文 康麗軍 翁繩鳳 朱新穎

目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病人數(shù)的14.3%，位居世界第2位，結(jié)核分枝桿菌感染率高，人感染結(jié)核分枝桿菌后，大部分會(huì)成為無癥狀的潛伏性結(jié)核感染者（latent tuberculosis infection，LTBI）。然而當(dāng)機(jī)體免疫力降低時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌大量增殖，引發(fā)臨床疾病。盡早發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染是預(yù)防與控制結(jié)核病傳播的重要手段之一。北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司研制的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)γ－干擾素檢測試劑盒（體外釋放酶聯(lián)免疫法）（Wantai quantitative diagnostic kit for Mycobacterium tuberculosis IFN－γrelease assay，WT－IGRA）（簡稱 WT 試劑）與澳大利亞Cellestis有限公司生產(chǎn)的QuantiFERON·－TB試劑盒 （QuantiFERON·－TB GOLD in tube，QFTGIT）（簡稱QFT試劑）的檢測原理一致，均是檢測結(jié)核特異性抗原介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。抗原ESAT－6、CFP－10和 TB7.7為致病性結(jié)核分枝桿菌特有，而卡介苗沒有的片段［1]。LTBI體內(nèi)擁有針對這些抗原的特異性T淋巴細(xì)胞，能識(shí)別、遞呈這些抗原，并刺激T淋巴細(xì)胞增殖、釋放細(xì)胞因子，如γ－干擾素［1]（IFN－γ）。而 QFT 試劑和 WT 試劑可以定量檢測這些釋放的特異性IFN－γ。為各級醫(yī)療單位的結(jié)核分枝桿菌感染診斷提供一種間接的檢測方法，為臨床醫(yī)生提供一種結(jié)核病尤其是肺外結(jié)核的輔助診斷方法。筆者用2種試劑檢測病區(qū)與門診結(jié)核病患者（249例）及健康者（140例）的全血標(biāo)本，評價(jià)干擾素體外釋放酶聯(lián)免疫法（quantitative diagnostic kit for Mycobacterium tuberculosis IFN－γrelease assay，TB－IGRA）在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

對象和方法

一、對象

249例結(jié)核病患者來自2010年10月12月北京老年醫(yī)院感染門診和感染病房；其中男性159例，女性90例，平均年齡44歲；痰菌陽性肺結(jié)核（痰抗酸桿菌涂片陽性或培養(yǎng)陽性）58例，痰菌陰性肺結(jié)核（痰抗酸桿菌涂片及培養(yǎng)均陰性）95例，痰菌陰性肺外結(jié)核（痰抗酸桿菌涂片及培養(yǎng)均陰性）14例，實(shí)驗(yàn)室結(jié)果不全結(jié)核病患者82例（無痰抗酸桿菌涂片及培養(yǎng)結(jié)果）；菌陰肺結(jié)核的診斷主要是根據(jù)臨床癥狀及影像檢查并參照菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)排除其他疾病后確診為痰菌陰性肺結(jié)核［2]。普通人群140例，其中28例為北京老年醫(yī)院檢驗(yàn)科工作人員或其家屬［其中LTBI人群（PPD 3＋～4＋）11例] ，男性64例，女性76例，平均年齡31歲；LTBI［無結(jié)核癥狀，但結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）結(jié)果≥20mm，包括出現(xiàn)水泡的人群] 20例；正常對照（明確為非結(jié)核病患者，且PPD＜3＋，無水泡的普通人群）120例。

二、儀器和試劑

Mutiskan MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司生產(chǎn)。WT試劑與QFT試劑。

三、方法（按說明書方法進(jìn)行）

1.WT試劑試驗(yàn)步驟：首先，使用BD（美國BD公司）肝素鋰抗凝采血管抽取超過5ml靜脈血，馬上輕柔地顛倒混勻3次以上，使抗凝劑充分溶解。采集到全血分裝到3種不同的培養(yǎng)管中。“T”為添加了結(jié)核特異性抗原ESAT－6、CFP－10的測試培養(yǎng)管；“N”為本底對照培養(yǎng)管；“P”為添加了非特異刺激抗原植物血球凝集素（PHA）的陽性對照培養(yǎng)管。每種培養(yǎng)管分裝1ml，分裝前需要顛倒混勻3次以上。分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管5次，立刻于37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（22±2）h。靜置培養(yǎng)（22±2）h后取出，離心收集上清液。其次，用雙抗體夾心法定量檢測上清液中IFN－γ的含量。根據(jù)刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中特異性升高的IFN－γ的量，來判定是否為結(jié)核分枝桿菌感染陽性。理論上每位受試者都能對非特異刺激抗原PHA產(chǎn)生反應(yīng)。

2.QFT試劑試驗(yàn)步驟：QFT試劑新鮮全血標(biāo)本采集，利用參考試劑中提供的3種不同的采血管，按照本底對照培養(yǎng)管、結(jié)核特異性抗原測試培養(yǎng)管、非特異刺激抗原陽性對照培養(yǎng)管的順序分別采集1ml靜脈血，馬上輕柔的顛倒搖勻3次以上，使抗凝劑充分溶解。新鮮全血經(jīng)刺激培養(yǎng)（22±2）h后，（1080～3130）×g離心10min，取上清液放于新的環(huán)氧樹脂（EP）管中，完成酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料組間比較，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TB－IGRA檢出結(jié)核分枝桿菌感染的陽性率和特異度

結(jié)核患者249例，正常對照120例，LTBI 20例，檢測結(jié)果見表1。140例普通人群中，28例為北京老年醫(yī)院檢驗(yàn)科的工作人員或其家屬，WT試劑陽性率 46.4%（13／28），QFT試劑陽性率67.8%（19／28），PPD 3＋～4＋率為39.3%（11／28）。WT試劑特異度、QFT試劑特異度均為83.3%（100／120）。

表1 結(jié)核組與正常對照組的WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結(jié)果

表2 痰菌陽性組與痰菌陰性組WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結(jié)果

二、菌陽和菌陰結(jié)核病患者WT試劑和QFT試劑陽性率比較

無痰抗酸桿菌涂片及培養(yǎng)結(jié)果的82例結(jié)核病患者未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。痰菌陰性結(jié)核病患者WT試劑陽性率為76.1%［（71＋12）／（95＋14）] ，痰菌陰性結(jié)核病患者 QFT試劑陽性率65.1%［（61＋10）／（95＋14）] （表2）。痰菌陽性組與痰菌陰性組比較，WT試劑χ2＝0.082，P＞0.05；QFT 試劑χ2＝0.075，P＞0.05，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。痰菌陰性肺結(jié)核組與痰菌陰性肺外結(jié)核組比較，WT試劑χ2＝0.081，P＞0.05；QFT 試劑χ2＝0.280，P＞0.05，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

三、PPD結(jié)果與TB－IGRA結(jié)果之間的相關(guān)性

PPD與WT試劑、QFT試劑的相關(guān)性，由強(qiáng)到弱，呈明顯遞減趨勢；PPD檢測結(jié)果為3＋～4＋，WT試劑的檢出陽性率77.9%（67／86），QFT試劑的檢出陽性率68.6%（59／86）；PPD檢測結(jié)果為陰性，WT試劑的檢出陽性率43.5%（10／23），QFT試劑的檢出陽性率30.4%（7／23）（表3）。

表3 WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結(jié)果與PPD相關(guān)性（例）

四、WT試劑與QFT試劑符合率

WT試劑與QFT試劑陽性符合率為91.9%［181／（181＋16＋0）×100%] ，陰性符合率為77.0%［147／（44＋147＋0）×100%] ，總符合率為84.3%［（181＋147＋0）／（197＋191＋1）×100%] （表4）。

討 論

目前常用的結(jié)核診斷方法有X線胸片、PPD試驗(yàn)、抗酸染色、結(jié)核（TB）－聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測等。傳統(tǒng)的抗酸桿菌染色及結(jié)核桿菌培養(yǎng)都因其敏感度、特異度及檢測速度等方面的問題而不能滿足臨床需要。近年來，針對結(jié)核桿菌特異性蛋白的TB－IGRA已普遍用于結(jié)核桿菌感染的診斷。TBIGRA的原理是檢測機(jī)體對結(jié)核桿菌特異性蛋白ESAT－6、CFP－10和 TB－7.7的免疫反應(yīng)。與PPD試驗(yàn)用的結(jié)核菌素不同，這些蛋白在所有結(jié)核分枝桿菌及致病性牛分枝桿菌中特異表達(dá)，而在卡介苗和大多數(shù)非結(jié)核分枝桿菌中不表達(dá)［1]。因此，TB－IGRA檢出結(jié)核桿菌感染的特異度和敏感度都較高。

表4 WT試劑和QFT試劑TB－IGRA結(jié)果符合率（例）

一、TB－IGRA檢出結(jié)核桿菌感染的特異度和敏感度

本試驗(yàn)中，在249例結(jié)核患者中，WT試劑陽性率76.3%，QFT 試劑陽性率67.1%，WT 試劑和QFT試劑特異度都是83.3%，與國內(nèi)使用相同試劑所做的試驗(yàn)有差異。張華等［3]報(bào)道 WT試劑陽性率90.24%，特異度93.34%，李曉非等［4]報(bào)道WT試劑陽性率90.9%，特異度76.9%，分析其中的原因可能與標(biāo)本量的大小、標(biāo)本的來源有關(guān)。WT試劑盒于2010年在昆明市第三人民醫(yī)院、北京老年醫(yī)院、廈門市疾病預(yù)防控制中心同時(shí)使用，標(biāo)本量擴(kuò)大到786例，其中有637例陽性，陽性率為81.0%。本試驗(yàn)檢測菌陽病區(qū)結(jié)核患者、菌陰肺外結(jié)核患者陽性檢出率較高，WT試劑分別為88.2%（15／17）、85.7%（12／14）。也和國外報(bào)道接近［5]。

二、菌陽和菌陰結(jié)核病患者WT試劑和QFT試劑陽性率比較

菌陽和菌陰結(jié)核病患者WT試劑陽性率分別為74.1% （43／58），76.1% （83／109），χ2＝0.082，P＞0.05，QFT試劑陽性率分別為67.2%（39／58），65.1%（71／109），χ2＝0.075，P＞0.05，菌陰肺結(jié)核與菌陰肺外結(jié)核患者WT試劑陽性率分別為74.7%（71／95），85.7%（12／14），χ2＝0.081，P＞0.05，QFT試劑陽性率分別為64.2%（61／95），71.4%（10／14），χ2＝0.280，P＞0.05，上述差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于TB－IGRA可作為評估抗結(jié)核治療療效的理想指標(biāo)［6]的結(jié)論還需進(jìn)一步論證。

三、TB－IGRA檢測結(jié)核潛伏感染意義

由于目前缺乏檢測結(jié)核潛伏感染特異性的黃金標(biāo)準(zhǔn)，以無結(jié)核癥狀，但PPD結(jié)果3＋～4＋的人群定義為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染［7]，從表1可以看到，QFT試劑 TB－IGRA 陽性率為60.0%（12／20）；北京老年醫(yī)院檢驗(yàn)科28例工作人員和家屬中，PPD 3＋～4＋率為39.3%（11／28），QFT試劑TB－IGRA陽性率為67.8%（19／28），北京老年醫(yī)院檢驗(yàn)科是結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室，有大量的含結(jié)核分枝桿菌的痰標(biāo)本，其工作人員或多或少接觸結(jié)核分枝桿菌，均是結(jié)核分枝桿菌的密切接觸者。Brodie等［8]報(bào)道TB－IGRA值與結(jié)核患者的密切接觸程度相關(guān)，且不受機(jī)體免疫力及卡介苗接種的影響。此次研究發(fā)現(xiàn)，北京老年醫(yī)院檢驗(yàn)科工作人員工作時(shí)間長短（密接程度）與TB－IGRA值大小無正比例關(guān)系，其中1例工作時(shí)間最長，但TB－IGRA為陰性。即使這樣，這項(xiàng)研究表明，TB－IGRA和PPD 2種檢測方法對結(jié)核潛伏感染的檢出都有一定的作用。當(dāng)PPD檢測結(jié)果為3＋～4＋，WT試劑陽性檢出率為77.9%（67／86）。但 PPD 檢測可能增加其后 TBIGRA中對干擾素的應(yīng)答水平。南非一項(xiàng)研究顯示，篩查結(jié)核潛伏感染可采用先PPD檢測后TBIGRA的二步策略，但TB－IGRA須在PPD檢測之后的3d內(nèi)進(jìn)行［9]。

四、WT試劑與QFT試劑符合率

這個(gè)研究采用2個(gè)廠商的試劑是為了更好評價(jià)TB－IGRA方法的真正價(jià)值。雖然原理相同，但2種試劑結(jié)果仍存在差別，389例中有61例結(jié)果不符（見表4）；總的來說，WT試劑與QFT試劑符合率良好，達(dá)84.3%。但TB－IGRA方法在中國要應(yīng)用到臨床中還有很多工作需要做，特別是不同廠商試劑結(jié)果的可比性，方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化、臨界值（cut off值）合理性等還需要做進(jìn)一步的研究。

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