熒光染色發光二極管顯微鏡檢測結核分枝桿菌的效果分析

陳燕梅 錢明 江勇 陳濤 李海成 鐘球

目前痰涂片染色鏡檢常用有2種染色方法：萋－尼染色法 （簡稱Z－N染色法）和金胺O熒光染色法［1]。前者是使用已有百余年歷史的染色技術，因為其操作簡單、費用低、速度快，1h可以報告結果而一直延用至今。這種方法在標本量少，工作量不大的情況下是一種不錯的篩查結核病檢測結核分枝桿菌的方法；但對于標本量多、工作量大、實驗人員少的單位，此法就難以滿足臨床需要，因此尋找一種更快速、靈敏的方法來幫助檢測結核分枝桿菌就顯得尤為重要。

材料和方法

一、試劑和器材

熒光法染色液（包括金胺O初染液、脫色液、高錳酸鉀復染液）和Z－N染色液（包括石碳酸復紅液、脫色液、亞甲藍復染液）均按《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》［2]進行配制；使用LEICA DM 1000發光二極管全冷光源熒光顯微鏡及奧林巴斯CH40生物顯微鏡。

二、檢測標本

痰標本來自2010年1月至2010年12月粵西地區2個縣結核病門診就診的可疑肺結核患者，全部為初診患者。本實驗共收集232例患者的痰標本696份。每位患者收集3份深咯痰標本，分別為清晨痰、夜間痰和即時痰。標本量為3～5ml，每份痰標本涂抹2張玻片，分別進行Z－N染色和金胺O熒光染色。

三、涂片

用竹簽挑取痰標本的膿樣、血樣或干酪樣部分約0.05～0.1ml于玻片正面的右側2／3中央處，并均勻涂抹成1.0cm×2.0cm橢圓形痰膜，厚薄適中。室溫下自然干燥。

四、Z－N染色和金胺O熒光染色

均按《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢及質量保證手冊》進行初染、脫色、復染。

五、鏡檢及結果判定

Z－N染色用普通光學顯微鏡鏡檢，10倍目鏡、100倍油鏡觀察。在淡藍色背景下，結核分枝桿菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍色。熒光染色用發光二極管顯微鏡，10倍目鏡、40倍物鏡觀察痰涂片，在暗視野背景下，結核分枝桿菌呈現橘黃色熒光，呈桿狀或短棒狀。Z－N鏡檢結果報告標準為：抗酸桿菌陰性：連續觀察300個不同視野，未發現抗酸桿菌；抗酸桿菌陽性（報告抗酸桿菌菌數）：1～8條／300視野；抗酸桿菌陽性（1＋）：3～9條／100視野；抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條／10視野；抗酸桿菌陽性（3＋）：1～9條／每視野；抗酸桿菌陽性（4＋）：≥10條／每視野；報告1＋至少觀察300視野，2＋至少觀察100個視野，3＋、4＋時至少觀察50個視野。LED鏡檢結果報告標準為：熒光染色抗酸桿菌陰性：0條／50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（報告抗酸桿菌菌數）：1～9條／50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（1＋）：10～49條／50視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（2＋）：1～9條／每視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（3＋）：10～99條／每視野；熒光染色抗酸桿菌陽性（4＋）：＞100條／每視野；報告2＋至少觀察50視野，3＋及以上至少觀察20個視野。

六、資料的統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件，率采用配對χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

LED組232例可疑結核病患者的痰標本中檢出88例陽性，陽性率為37.9%；Z－N組檢出62例陽性，陽性率為26.7%；χ2＝6.66，P＜0.01，差異有統計學意義（表1）。在檢測1＋或以下菌量的標本時，LED組鏡檢組陽性率為14.22%，Z－N組陽性率為6.17%；χ2＝24.59，P＜0.01，差異有統計學意義（表2）。兩種染色方法均以干酪痰陽性檢出率最高，干酪痰涂陽率＞黏液痰涂陽率＞唾液痰涂陽率，它們的涂片陽性率分別為 78.9%、23.9%、7.5%和81.6%、38.3%、11.9%（表3）。表3結果還顯示，LED組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝50.00，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝100.73，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較χ2＝33.16，P＜0.01。Z－N組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝92.7，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝111.52，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較χ2＝17.50，P＜0.01。

表1 Z－N染色和金胺O熒光染色結核分枝桿菌檢測結果分析（例）

表2 Z－N染色和金胺O熒光染色結核分枝桿菌檢測結果比較

表3 兩組不同性狀痰標本結核分枝桿菌陽性檢測結果

討 論

LED方法染色鏡檢時抗酸桿菌在暗視野背景下發出橘黃色熒光，黑色背景與抗酸桿菌對比鮮明，非常明顯容易發現，熒光染色讀片放大倍數為400倍（40倍物鏡，10倍目鏡），所觀察的視野面積大，故它的靈敏度比Z－N方法普通顯微鏡鏡檢高［3－4]；LED 組 與 Z－N 組 在 特 異 度 上 亦 無 差 異［5]。本研究結果顯示，LED組檢出陽性率為37.9%，Z－N組為26.7%，χ2＝6.66，P＜0.01，兩者的陽性檢出率差異有統計學意義；兩組陽性檢出率差異主要體現在結果為1＋及以下的標本，即含菌量少的痰標本上，LED 組為14.2%，Z－N 組6.2%，χ2＝24.59，P＜0.01，差異有統計學意義，而2＋、3＋、4＋的陽性率P值均大于0.05，差異無統計學意義。這表明痰標本含菌量較少時直接涂片LED法鏡檢較Z－N法具有更高的靈敏度，這樣可防止漏診的出現，對于那些病變活動性輕、排菌量較少的肺結核診斷具有重要意義，及時準確發現這部分具有傳染性的肺結核患者對于我國的結核病預防控制、流行病學調查、治療等有重大意義。

結果同時顯示，兩種染色方法均以干酪痰陽性檢出率最高，干酪痰涂陽率＞黏液痰涂陽率＞唾液痰涂陽率，它們的涂片陽性率分別為78.9%、23.9%、7.5%和81.6%、38.3%、11.9%。血痰是干咳引起的細支氣管破裂出血或病灶出血與膿痰或黏液痰混合而成的標本，故根據肉眼判斷而將之歸為干酪痰或黏液痰。LED組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝50.00，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝100.73，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較，χ2＝33.16，P＜0.01；Z－N 組：干酪痰與黏液痰比較，χ2＝92.70，P＜0.01；干酪痰與唾液痰比較，χ2＝111.52，P＜0.01；黏液痰與唾液痰比較，χ2＝17.50，P＜0.01，差異具有統計學意義。提示為了提高結核患者的發現率和痰檢陽性率，無論采用何種的檢測方法都應注意收集合格的痰標本，尤其是收集膿性干酪樣的痰標本進行檢查，痰標本的質量直接影響檢驗的結果。

熒光染色讀片放大倍數為400倍（40倍物鏡，10倍目鏡），所觀察的視野面積大，觀察相同面積視野所需時間短，報告陰性結果只需讀片50個視野（通常需2min左右）。由于讀片時間短，所以可加快痰標本的篩查速度。而Z－N法鏡檢讀片放大倍數為1000倍（100倍物鏡，10倍目鏡），油鏡觀察視野范圍小，報告陰性結果需讀片300視野或需讀片5min左右；鏡檢人員容易出現視覺疲勞。往往容易漏診掉一些菌含量少的痰液標本，亦往往制約檢驗人員的工作量。因此LED鏡檢更適合用于工作量大、標本量多的單位使用，可提高工作效率，及時滿足臨床早期診斷的需要。

LED法較Z－N法有節約試劑、減少試驗成本、簡化操作的優勢。染色時無需加熱，可降低實驗人員因加熱而吸入有害物質的危險。不需使用鏡油和擦鏡紙等消耗品，LED法與Z－N法染色1張涂片所需的初染液、脫色液、復染液的用量基本相同，每張涂片需初染液、復染液各約3ml，需脫色液約6ml，購買試劑的費用亦相差不多。而LED法省略了初染色加熱、滴加鏡油和擦鏡的步驟，故無論在操作流程或者成本上都比Z－N法略勝一籌。

直接痰涂片染色鏡檢時，LED法檢測比Z－N法具有讀片時間短、操作容易、檢出率高（特別是對含菌量少的痰標本）、費用低等優點，是一種檢查結果可靠、敏感度較高、工作效率高的方法，所以更適合結核病實驗室開展。痰涂片的某些雜質經過熒光染色在LED鏡下都呈現與結核分枝桿菌相似的黃色桿狀或短棒狀，這就需要很有讀片經驗的人來區分細菌與雜質，包括治療前后細菌形態的變化，讀片的人要熟練掌握和識別抗酸桿菌的形態，所以對沒有熒光鏡檢經驗的實驗室，在開展LED方法前，有必要開展熒光涂片和讀片培訓。

［1] 中國防癆協會基礎專業委員會.結核病診斷實驗室檢驗規程.北京：中國教育文化出版社，2006：13－29.

［2] 中國疾病預防控制中心.中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢質量保證手冊.北京：中國協和醫科大學出版社，2004：23－51.

［3] Albert H，Manabe Y，Lukyamuzi G，et al.Performance of three LED－based fluorescence microscopy systems for detection of tuberculosis in Uganda.PLoS One，2010，5（12）：e15206.

［4] 尚美，劉冠，趙立平，等.發光二極管熒光顯微鏡實驗室診斷效果評價.中國防癆雜志，2010，32（5）：275－278.

［5] Anthony RM，Kolk AH，Kuijper S，et al.Light emitting diodes for auramine O fluorescence microscopic screening of Mycobacterium tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis，2006，10（9）：1060－1062.