華蟾素注射液對人肝癌HepG-2細胞增殖及周期的影響

孫 宇 盧辛辛 梁鑫淼 崔曉楠*

(1 大連醫科大學第一附屬醫院腫瘤科，遼寧 大連 116002；2 中科院大連化學物理研究所，遼寧 大連 116023）

肝癌的藥物治療處于滯后狀態，目前化療藥物對肝癌的有效率均＜20%[1]，靶向藥物對于肝癌的治療還處于研究階段。尋找、研究有效的抗肝癌藥物一直是肝癌治療的熱點問題。華蟾素注射液（Cinobutacini injection，CINO） 為祖國醫學傳統抗腫瘤藥物蟾蜍的水溶制劑，其有效成分總稱為蟾蜍毒素類（Bufotoxins）, 包括蟾蜍甾二烯類、強心甾烯蟾毒類、吲哚堿類、醇類及多糖、氨基酸、肽類、腎上腺素等[2]，對多種腫瘤有抑制增殖的作用，尤其對肝癌的有效率可達44.4%[3]，是一個很有發展前景的抗肝癌藥物。但是，其作用機制還有待于進一步明確。本實驗探討華蟾素注射液對人肝癌HepG2細胞的增殖及周期有何影響，并初步分析可能存在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及培養

細胞株為人肝癌HepG2（購于中國科學院上海細胞研究所）；低糖IMEM培養基、10%新生牛血清購于GIBICO公司；將細胞置于培養箱中孵育（培養箱設為37℃、5%CO2、飽和濕度），每48h傳代1次。實驗細胞采用對數生長期細胞。

1.2 實驗藥品及試劑

華蟾素注射液（5mL/支，濃度以主要成分吲哚生物堿為標量測定，購于安徽省金蟾生化股份有限公司），實驗時應用培養基將其配制成不同濃度的藥液。MTT為biosharp公司產品；碘化丙啶和RNA酶A購于Sigma公司；CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測試劑盒購自上海杰美基因醫藥科技有限公司。RT-PCR試劑盒購自Promega公司。

1.3 MTT法檢測細胞生長情況

將細胞接種到96孔培養板上，5000個細胞/孔，每組設立8個平行孔。培養24h后將培養基更為含不同濃度華蟾素注射液的培養液（0.006μg/mL、0.013μg/mL、0.026μg/mL、0.053μg/mL、0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL），200μL/孔，設立空白對照組和陰性對照組（未加華蟾素注射液）。分別培養24h、48h、72h后，每孔加入20μL的MTT液（濃度為5mg/mL），再避光培養4h后除去培養液，加入二亞基亞砜（DMSO）150μL/孔，震蕩后使結晶完全溶解，置于酶標儀下將波長設為570nm，應用空白孔調零，測定各孔吸光值（B）。應用公式計算華蟾素注射液在不同濃度下對HepG2細胞生長的抑制率（IR）：IR（%）=（B對照-B試驗）/（B對照-B空白）×100%；半數抑制濃度（IC50）的計算：取細胞存活率和劑量對數作圖求出IC50值。實驗共重復4次。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期分布

取細胞并將細胞配成2×106個/m2的濃度，分別取2mL接種到3個培養瓶內，培養24h后，應用PBS沖洗1次，進行同步化（即將培養基更為無血清的DMEM培養20h），再更為含有華蟾素注射液的正常培養基（其終濃度為0.21μg/mL），分別培養48h、24h、12h后，應用0.25%的胰蛋白酶消化下細胞，離心（1000r/min，10min）后棄去上清，應用冷PBS沖洗2次，再加入70%的冷乙醇，置于4℃下固定12h。用PBS沖洗2次，離心后棄去上清液，加入25μL濃度為2mg/mL的RNaseA，置于37℃下作用30min，再加入1mg/mL的PI染料25μL，于4℃下避光靜置30min后，應用流式細胞儀（發射波長630nm，激發波長488nm）檢測凋亡細胞的數量和細胞周期分布情況。實驗共重復4次。

表1 RT-PCR法檢測CDK2mRNA、CyclinA mRNA表達水平

1.5 RT-PCR法檢測CDK2mRNA、CyclinA mRNA表達水平

取細胞，接種于24孔板中，每孔 5×105個細胞，設華蟾素注射液濃度為0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL為實驗組，設培養基組為陰性對照組，培養48h后收集各組細胞。提取各組總RNA時應用Trizol試劑盒（購于Invitrogen公司）并按其說明進行。RT-PCR的操作按照說明書進行（TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0），以cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件見表1。

將擴增產物加入到濃度為1.5%瓊脂糖凝膠上，置于1×TBE緩沖液中，在電壓為90v作用下電泳30min，于紫外透視儀下觀察顯示電泳帶并用一次性成像儀掃描成像，然后進行灰度（ID）分析。實驗共重復4次。1.6 CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測

取細胞，將細胞配成1×105個/mL的濃度，取2mL接種于直徑為60mm的培養皿內，孵育24h后，分別加入華蟾素注射液（0.42μg/mL、0.21μg/mL、0.105μg/mL），并設立陰性對照組（未加藥物），培養48h，后續操作按該試劑盒內的說明書進行，并在酶標儀下（波長設為340nm）進行檢測。

樣品的活性=[（樣品讀數-背景讀數）×樣品稀釋倍數×0.1（體系容積，mL）]/[0.005（樣品容積，mL）×6.22（毫摩爾吸光系數）×0.6cm×5min]=U/mL

2 結 果

2.1 MTT法檢測腫瘤細胞生長狀態

不同濃度的華蟾素注射液干預HepG-2細胞24h、48h、72h 后，IC50分別為0.48μg/ mL、0.157μg/ mL、0.08μg/ mL，隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，其對細胞的抑制率逐漸增加，并與時間和濃度呈正相關。見圖1。

2.2 流式細胞術檢測細胞周期分布

濃度為0.105μg/mL的華蟾素注射液，作用HepG2細胞12h、24h、48h后，通過流式細胞儀檢測分析，結果示： S期HepG2細胞所占比例與藥物作用時間呈正比，具有時間依賴性，與對照組相比差異具有顯著性（P＜0.05）。見圖2。

2.3 RT-PCR法檢測CyclinA mRNA、CDK2mRNA表達水平

應用RT-PCR法檢測華蟾素注射液（0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL）作用于HepG2細胞48h后，其CyclinA及CDK2 mRNA表達水平有何變化。實驗組與對照組比較，隨著藥物濃度的增加CyclinA mRNA、CDK2 mRNA表達水平減低，應用華蟾素注射液0.105μg/mL、0.21μg/mL、0.42μg/mL作用于HepG2細胞后，CyclinA mRNA與β-actin mRNA條帶灰度比值分別為（0.455±0.021）、（0.272±0.035）、（0.132±0.02），對照組灰度比值為（0.550±0.04），條帶3、4（即華蟾素注射液濃度為0.21μg/mL、0.42μg/mL）與對照組相比具有差異具有顯著性（P＜0.05），見圖3-1；CDK2 mRNA、β-actin mRNA條帶灰度比值分別為（0.266±0.021）、（0.167±0.015）、（0.117±0.020），對照組為（0.445±0.016），實驗組與對照組相比差異具有顯著性（P＜0.05），見圖3-2。

2.4 CDK2/CyclinA激酶活性比色法定量檢測結果

應用比色法定量法檢測華蟾素注射液作用于HepG2細胞48h后，CDK2/CyclinA激酶的活性與藥物濃度呈負相關，對照組與各濃度組間差異具有顯著性 （P＜0.05）。見圖4。

3 討 論

腫瘤為細胞周期疾病，通過阻斷細胞周期，實現對腫瘤的生長抑制是目前抗腫瘤藥物的重要機制。

我們的研究表明華蟾素注射液能抑制HepG-2細胞增殖，并將細胞阻滯于S期。為探討S期阻滯機制，我們觀察了華蟾素注射液對細胞周期素A（cyclinA）及細胞周期素依賴性激酶2（cyclins dependent kinases 2，CDK2）的影響。cyclinA是人類cyclins家族中重要成員之一，在細胞周期中起正相調節作用，它首次被檢測到是在原發性肝癌細胞中，在與HBV DNA的整合部位上，這種整合被認為是導致肝癌的主要原因。cyclinA存在于細胞核內，在DNA合成過程中的G1晚期出現，其作為調節亞基與相應的細胞周期素依賴性激酶（cyclins dependent kinases，CDK）中的CDK2、CDC2（cell division cycle 2）特異性結合，參與細胞DNA的復制及合成，并促進細胞進行分裂。CyclinA/ CDK2/CDC2復合物可使細胞順利完成并通過S期、G2/M期，如果該復合物表達出現異常，則可使具有缺陷的DNA喪失修復的時間而直接進入細胞周期，致使其出現異常增殖即生成腫瘤[4-7]；而且也是腫瘤細胞惡性增殖及預后不良的指標之一[8,9]。Dobashi Y等在對非小細胞肺癌的研究中發現CyclinA 、CDK2表達與S期細胞數量呈正相關與患者的生存期呈負相關[10]。本研究表明華蟾素注射液能下調CyclinA、CDK2mRNA水平表達，抑制CyclinA、CDK2活性。

我們的研究提示，華蟾素注射液可能通過影響CyclinA、CDK2實現對HepG-2細胞S期阻滯。

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