反相離子對高效液相色譜法測定硫酸奈替米星滴眼液含量

楊 帆

（廣西醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院／柳州市工人醫(yī)院 藥劑科，廣西 柳州545001）

奈替米星（Netilmicin）是一種新的氨基糖苷類藥物，為半合成的氨基糖苷類抗生素，對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌具有抑菌和殺菌作用，不良反應(yīng)較同類藥物小，國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用于臨床。將其制成滴眼液可用于多種細菌及耐藥菌造成的眼部感染。該類抗生素多為紫外末端吸收或無紫外吸收，故很難用紫外分光光度法直接測定其含量。中國藥典2005版采用抗生素微生物檢定法測定硫酸奈替米星含量，但該法操作繁瑣、費時。近年來也有文獻報道采用旋光法、柱前衍生化法、高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測法［4］等，前兩種方法受實驗影響因素較多，后者因需對檢測結(jié)果進行數(shù)學處理而稍顯復雜，我們建立了反相離子對高效液相色譜法直接測定其含量。通過在pH＝3.0的條件下，在1.5%的磷酸二氫鉀溶液中加入離子對試劑十二烷基硫酸鈉，被測物奈替米星與十二烷基硫酸鈉生成離子對，并用乙腈調(diào)節(jié)流動相的極性，以調(diào)節(jié)出峰時間，主峰與雜質(zhì)峰分離良好。此法對硫酸奈替米星滴眼液的含量測定，取得了較滿意的結(jié)果，現(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥及實驗條件

1.1 儀器與試藥

LC－10ATvp高效液相色譜儀，包括SPD－10Avp紫外檢測器、CLASS－VP Ver 6.12SP1工作站（日本島津公司）；UV－2401－PC紫外分光光度計（日本島津公司）；電子PHS－3F酸度計（上海電子光學技術(shù)研究所）；BP211D電子天平（德國賽多利斯公司）；KDC－16H高速臺式離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；0412－1離心機（上海手術(shù)器械廠）。注射用硫酸奈替米星（南京圣和藥業(yè)有限公司，批號：200608232青島第三制藥廠，批號070801）；硫酸奈替米星標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0355－200001）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 實驗條件

（1）以1.5%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH為3.0，十二烷基硫酸鈉10mmol／L）－乙腈（85：15）為流動相。實驗色譜柱：Diamonsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流速：0.8mL／min；柱溫：30℃；進樣量：20μL；檢測波長：205nm。

（2）含量測定按照高效液相色譜法《中國藥典2005年版》二部附錄V附錄VD測定。色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以1.5%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH 為3.0，十二烷基硫酸鈉10mmol／l）－乙腈（85：15）為流動相；檢測波長為205nm。理論塔板數(shù)按硫酸奈替米星計算不低于1 500，硫酸奈替米星峰與各雜質(zhì)峰之間能良好地分離。

2 系統(tǒng)適用性實驗

按本品種項下要求對儀器進行系統(tǒng)適用性實驗，應(yīng)能達到規(guī)定的要求，方能進行實驗。按該色譜系統(tǒng)分析條件下色譜峰的理論塔板數(shù)、分離度、重復性應(yīng)達到要求。

色譜柱的理論塔板數(shù)（n）在所選擇的條件下，注入供試品溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰的保留時間tR和半峰高寬（Wh／2）按n＝5.54（tR／Wh／2）2計算色譜柱的理論塔板數(shù)，經(jīng)計算所得的理論塔板數(shù)符合要求。

分離度。定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其他峰之間有較好的分離度，分離度（R）的計算公式為：R＝2（tR1－tR2）／（W1＋W2），式中tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間；tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間，W1和 W2為此相鄰兩峰的峰寬；根據(jù)實驗得出的分離度大于1.5，符合要求。

重復性。取該品種項下的標準溶液，連續(xù)進樣6次，峰面積測量值的相對標準偏差為0.58%，實驗證明重復性符合要求。

3 方法與結(jié)果

3.1 滴眼液的處方

硫酸奈替米星5.0g，硼酸10.5g，硼砂2.87g，羥苯乙脂0.3g，注射用水加至1 000mL。

3.2 滴眼液的配制

取羥苯乙脂加適量新鮮注射用水溶解后，依次加入硫酸奈替米星、硼酸、硼砂使其全部溶解，濾過，自濾器上加注射用水至全量，攪勻，除菌，分裝即得。

3.3 滴眼液含量測定

3.3.1 專屬性實驗（輔料干擾實驗）

取處方量的輔料及注射用水按處方比例配制成輔料溶液，精密吸取2mL，加流動相稀釋至25mL容量瓶，搖勻，過0.45μm濾膜，取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明輔料在此條件下無吸收，對奈替米星的含量測定無干擾。

圖1 標準品色譜

圖2 供試品色譜

圖3 空白輔料實驗色譜

3.3.2 標準曲線的繪制

精密稱取硫酸奈替米星標準品適量（相當于125mg），用流動相配成5.0mg.mL－1的溶液，精密量取此溶液用流動相稀釋成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg.mL－1的溶液，搖勻，過0.45μm濾膜，分別取20μL進樣測得峰面積。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標回歸的直線方程為Y＝3.129×106X＋15 029，r＝0.999 8，n＝6。結(jié)果表明硫酸奈替米星在0.1～1.0mg·mL－1的濃度范圍內(nèi)，與峰面積線性關(guān)系良好。標準品重124.8mg，初體積25mL，初濃度4.992。

表1 硫酸奈替米星標準曲線的制備

圖4 標準曲線

3.3.3 穩(wěn)定性試驗

取標準曲線下濃度為0.40mg·mL－1的溶液分別在0h，1h，2h，3h，4h，8h，12h，24h測定，奈替米星在該流動相中24h內(nèi)是穩(wěn)定的，RSD為0.84%，n＝8。

表2 硫酸奈替米星穩(wěn)定性考察 （n＝8）

3.3.4 精密度試驗

取標準曲線項下濃度為0.40mg.mL－1的溶液，重復進樣6次，每次20μL，測定奈替米星的峰面積，結(jié)果RSD為0.58%。（見表3）

表3 硫酸奈替米星精密度試驗 （n＝6）

3.3.5 重復性試驗

取同一批樣品，按“樣品測定”項下的方法測定6次，其含量測定結(jié)果的RSD為0.92%。見表4。

表4 硫酸奈替米星滴眼液含量測定重復性試驗（n＝6）

3.3.6 加樣回收率試驗

按處方量分別配制高（120%）、中（100%）、低（80%）的硫酸奈替米星滴眼液，取樣2mL用流動相溶解25mL容量瓶定容后，過0.45μm濾膜，各取20μL進樣，測定奈替米星峰面積并計算回收率，測得平均回收率為100.1%，RSD為1.16%，n＝9，結(jié)果見表5。

表5 硫酸奈替米星滴眼液含量測定回收率實驗

3.3.7 樣品含量測定

取硫酸奈替米星滴眼液2mL，用流動相稀釋后配成0.4mg·mL－1的溶液；另取硫酸奈替米星標準品適量，用流動相配成0.4mg.mL－1的溶液。分別取上述溶液20μL進樣，按外標法以峰面積計算含量。三批樣品測定結(jié)果分別為100.9%、98.1%和99.7%。

表6 硫酸奈替米星滴眼液的含量測定

4 討論

（1）測定波長的選擇：取硫酸奈替米星標準品適量，用流動相溶解后，以流動相為空白，在190～400nm波長范圍內(nèi)掃描，硫酸奈替米星在205nm波長處有較大吸收峰，選擇205nm波長為測定波長。同時選用較低背景吸收的乙腈作為流動相中的有機相時，基線穩(wěn)定，對測定無干擾。

（2）色譜柱的選擇：反相離子對色譜法要求盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強的鍵合相，如C8或C18鍵合相。長鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，分離選擇性改善，使載樣量提高，長鏈烷基鍵合相的穩(wěn)定性也更好。因此，本實驗選擇了以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的Diamonsil C18柱為分析色譜柱。且本實驗條件流動相的pH值較低，而Diamonsil C18柱的pH適用范圍也較廣（1.5～8.0），故該柱符合實驗要求并能得到較好的分離效果。

（3）流動相的選擇：反相鍵合相色譜法中，流動相一般以極性最強的水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑。由于在檢測波長205nm處甲醇的吸光度較乙腈大許多，檢測時產(chǎn)生的噪音過大，而且甲醇的黏度也比乙腈大，會產(chǎn)生過高的柱壓，故選擇乙腈作為調(diào)節(jié)劑。乙腈比例越大，流動相的洗脫能力越強，奈替米星的容量因子就越小，保留時間也越短，直接影響到主峰與雜質(zhì)的分離效果。本實驗選取1.5%磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH為3.0）－乙腈（85：15）為流動相，并用此流動相作為溶媒溶解樣品使得用高效液相色譜法直接測定硫酸奈替米星含量成為可能，且輔料在此條件下無吸收，樣品在此流動相中穩(wěn)定性良好。

（4）氨基糖苷類抗生素多為紫外末端吸收或無紫外吸收，該類抗生素用HPLC法進行含量測定時多采用柱前衍生化法。但衍生化反應(yīng)影響因素多，增加了方法的系統(tǒng)誤差而且操作繁瑣。本文建立了奈替米星質(zhì)量控制的有效方法。

［1］陳新謙.新編藥物學［M］.第15版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：79.

［3］王建，胡小君，倪坤儀.HPLC－ELSD和 HPLC－MSn分析硫酸奈替米星及其注射液［J］.中國藥學雜志，2006，41（16）：1268－1271.

［4］韋敏，梁建成，肖億.改進微生物法監(jiān)測人體內(nèi)硫酸奈替米星血藥濃度［J］.2005，14（2）：126－127.

［5］楊毓芬.反相離子對色譜法檢測3種氨基糖苷類抗生素的混合樣品［J］.中國抗生素雜質(zhì)，1997，22（2）：152－153.