金櫻根多糖含量測定及提取工藝優選

郭巧玲，田素英

（1.廣東省新興中藥學校，廣東 新興527400；2.廣東藥學院 中山校區，廣東 中山528458）

金櫻根為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的干燥根、根皮，最早入藥記載見于《日華子本草》，為臨床常用中藥，有清熱解毒，涼血活血，祛瘀止痛，固精澀腸等功用，臨床應用廣泛，已被制成多種制劑，臨床效果良好［1］。多糖類化合物是多種中草藥的有效成分之一，具有多種生物活性。近年來研究顯示高等植物中所含多糖具有提高和恢復機體免疫功能、抗心肌缺血、抗應激、抗腫瘤等［2］功用。本實驗對金櫻根多糖提取工藝與含量進行研究，為開發利用金櫻根多糖，制定其質量標準提供科學依據。

1 主要儀器與材料

KQ－500型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TE52CS旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫水浴鍋B－220（上海亞榮生化儀器廠）；MV1102紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）。金櫻根（批號：090210、090901、1006284，均經廣東藥學院房志堅副教授鑒定為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的干燥根）；（＋）葡萄糖（AR，天津市津東天正精細化學試劑廠）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 含量測定

（1）對照品溶液的制備。精密稱取105℃恒溫干燥至恒重的葡萄糖60mg，用蒸餾水溶解并定容至100mL。搖勻，靜置。

（2）供試品溶液的制備。取金櫻根粗粉2g，加石油醚—乙醇（1∶2）混合液150mL，置250mL錐形瓶中，超聲20min，過濾，取藥渣揮干后，置錐形瓶中，加0.5%氫氧化鈉水溶液100mL，超聲20min。加稀鹽酸至提取液呈中性，置100℃水浴加熱20min，過濾，濾液加純水定容至100mL。

（3）最大波長測定。分別精密移取標準溶液和樣品液各0.5mL，分別置20mL容量瓶加純水定容。精密吸取各溶液2mL置具塞試管，分別加入4%苯酚水溶液1mL，搖勻后迅速加入濃硫酸7mL，搖勻，放入40℃溫水水浴30min，取出，冷卻10min，于400～520nm處波長掃描，讀取吸光度值，確定吸收峰，得到最大波長為485.0nm（見表1）。

表1 樣品最大波長紫外測定結果

（4）標準曲線制備［3］。精密移取對照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL，分 別 置 于20mL容量瓶，加純水定容。精密吸取各溶液2mL置具塞試管，按最大波長測定法于最大波長485nm處，以蒸餾水為空白，測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，對照品溶液濃度C（mg／mL）為橫坐標制作標準曲線。得標準曲線回歸方程為Y＝7.784 2X＋0.000 9，r＝0.999 3。結果表明，在溶液濃度為0～0.05mg／mL范圍內測定葡萄糖吸光度呈良好線性。

（5）顯色穩定性考察。精密移取對照品溶液和供試品溶液各0.8mL，分別置20mL容量瓶加純水定容。以冷水水浴10min，開始為0min，每隔10min記錄1次。RSD為1.58%（n＝9），結果表明，在10～90min區間內顯色穩定性良好（見圖1）。

（6）精密度考察。精密移取對照品溶液0.2mL置于20mL容量瓶，加純水定容，測定吸光度值。結果RSD%為0（n＝5），結果表明該精度良好。

（7）多糖含量測定。按上述制備方法取三批次樣品制成供試品溶液，分別精密移取各供試品溶液0.5mL，分別用純水定容至20mL。按標準曲線中苯酚—硫酸顯色法顯色，并記錄吸光度。代入標準曲線中計算總含糖量（124.593 8±2.150 6）mg。

圖1 顯色穩定性考察結果

（8）加樣回收試驗。精密稱取已知多糖含量的粗多糖溶液1mL 3份，依次加入不同量的葡萄糖標準貯備液，按上述操作方法測定供試品溶液的吸光度值，計算多糖回收率為94.70%，RSD為2.51%（n＝6）。

2.2 提取工藝的優選

2.2.1 單因素考察（超聲提取溫度60℃，提取時間20min）

氫氧化鈉溶液濃度選擇：精密稱量約1g／份的金櫻根粗粉共5份，按上述方法制備溶液，分別以濃度為1%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的氫氧化鈉為提取液50mL超聲提取，再用100℃水浴提取2h，過濾。吸取各濾液0.5mL，用純水定容至20mL。測定含糖量。結果表明，氫氧化鈉溶液濃度對金櫻根多糖的提取結果有影響，且2.5%濃度的氫氧化鈉提取結果較好。

料液比選擇：精密稱量約1g／份的金櫻根粗粉共5份，按上述方法制備溶液，分別以料液比為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，濃度為2.5%的氫氧化鈉溶液為提取液進行超聲提取，再用100℃水浴提取2h，過濾。吸取各濾液0.5mL，用純水定容至20mL。測定含糖量。結果表明，隨著料液比的提高糖的提取量也提高。

提取溫度選擇：精密稱量約1g／份的金櫻根粗粉共5份，按上述方法制備溶液，以2.5%氫氧化鈉溶液50mL超聲提取后，再分別60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴提取2h，過濾。吸取各濾液0.5mL，用純水定容至20mL。測定含糖量。結果表明，提取溫度對多糖的提取結果有影響，且隨著水浴溫度的提高，糖含量也相應提高?？赡苁且驗殡S著溫度的提高，金櫻多糖的溶解度不斷升高，所以，提取溫度越高，提取的多糖的量也就越多。由于水浴的最高溫度為100℃，故正交實驗考察最佳提取條件時不再考察溫度，直接用100℃進行水平提取。

提取時間選擇：精密稱量約1g／份的金櫻根粗粉共5份，按上述方法制備溶液，以2.5%氫氧化鈉溶液50mL超聲提取后，再分別0.5h，1h，1.5h，2.0h，2.5h，100℃水浴提取，過濾。吸取各濾液0.5mL，用純水定容至20mL。測定含糖量。結果表明，2.5h糖含量較多，有可能是在水浴過程中多糖鏈斷裂成單糖碎片，提高了多糖的溶解度。

2.2.2 正交試驗

根據金櫻根的提取性質考察了氫氧化鈉濃度、料液比、提取溫度和提取時間4個因素，并結合單因素試驗結果，設置3因素3水平正交試驗。根據因素水平表，以糖總含量為評價指標，采用L9（33）安排試驗，結果見表2。

表2 正交試驗優選因素水平與結果

表3 方差分析

實驗結果表明，對金櫻根多糖含量結果的影響因素顯著性順序為：料液比＞提取時間＞氫氧化鈉濃度。金櫻根多糖的提取最優工藝為：料液比1∶90，提取時間1h，氫氧化鈉濃度為2.5%。

3 討論

（1）本實驗同時采用單因素與正交試驗法優選提取工藝，結果獲得的最佳提取工藝條件為提取液氫氧化鈉濃度為2.5%，料液比為1∶90，100℃水浴提取1h。單因素考察的結果表明，料液比、提取溫度、提取液濃度和提取時間均對提取結果有影響，且在各因素所選的5個水平基礎上，各因素對結果影響的顯著性順序為：料液比＞提取溫度＞提取時間＞氫氧化鈉濃度。

（2）本實驗采用超聲提取和水浴提取相結合，實驗結果表明采用此提取方法提取時間對提取結果影響較小，可在較短時間內提取完成。與傳統的提取方法中20h以上的回流提取時間相比，大大縮短了提取時間。且超聲提取和水浴提取較簡便安全，為提取金櫻多糖的較佳提取方法。

［1］黃泰康.現代本草綱目［M］.上卷.北京：中國醫藥科技出版社，2001：61.

［2］吳梧桐，高美鳳，吳文俊，等.多糖的抗腫瘤作用研究進展［J］.中國天然藥物，2003，1（3）：15.

［3］任浩娜.中藥北沙參多糖與單糖組成和含量測定方法研究［D］.沈陽：沈陽藥科大學，2008.