高效液相色譜法測定杠板歸中槲皮素含量

楊佃志，戚秀萍

（山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安271000）

杠板歸為蓼科植物杠板歸（Polygonum perfoliatum（L.））的干燥地上部分。夏季開花時(shí)采割，本品為少數(shù)民族用藥，味酸、苦，性平，歸肺、小腸經(jīng)，具有清熱解毒、利濕消腫、散瘀止血的功效［1］。有文獻(xiàn)報(bào)道了采用雙波長薄層掃描測定杠扳歸糖漿中槲皮素的含量方法［2］，為更有效地對其進(jìn)行質(zhì)量控制，本文建立了杠扳歸藥材中槲皮素的高效液相色譜測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Water 600高效液相色譜儀，600泵；Water 2487紫外檢測器，威馬龍色譜工作站；電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），ODS Dikma C18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm）。

1.2 材料

杠板歸，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室陳德媛教授鑒定為杠板歸，藥材60℃干燥30min，粉碎，過40目篩。槲皮素對照品（批號：100081－200406），購自中國藥品生物制品檢定所，純度為97.3%；水為雙重蒸餾水；甲醇為色譜純；其他試劑為分析純。

2 色譜條件

流動相：MeOH－0.2%磷酸（55∶45），流速：1.0mL／min；檢測波長360nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為10μL，理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算大于6 000。在此條件下，槲皮素峰的tR為14.7min，與相鄰峰分離良好（R＞1.5）。

圖1 杠板歸藥材HPLC色譜

3 方法學(xué)考察

3.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)120℃干燥至恒重后，精密稱取槲皮素對照品4.08mg，置于10mL量瓶，加甲醇9mL，超聲溶解，冷卻至室溫后加甲醇定容至刻度，搖勻即得槲皮素對照品儲備液（0.397mg／mL）。精密吸取儲備液2mL，置10mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，槲皮素對照品溶液（79.4μg／mL）。

3.2 樣品溶液的制備

精密稱取杠板歸粗粉0.5g，置于50mL圓底燒瓶中，精密加入20%鹽酸乙醇溶液25mL，水浴加熱回流提取2h，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失重量，0.45μm微孔膜過濾，即得。

3.3 線性范圍關(guān)系考察

精密吸取儲備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mL，分別置于2mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積。以槲皮素對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)Y，峰面積積分值為坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為：Y＝2.64X×10－5＋3.81，r＝0.999 1（n＝5），表明槲皮素在19.8～198μg／mL的濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)樣6次，10μL／次，測定槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的峰面積，RSD為1.22%。

3.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取5μL對照品溶液，日內(nèi)差試驗(yàn)在同日內(nèi)測定，每個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，RSD為2.40%（n＝5）；日間差試驗(yàn)在連續(xù)5日內(nèi)測定，RSD為2.18%（n＝5）。通過對標(biāo)準(zhǔn)品日內(nèi)及日間進(jìn)樣測定，結(jié)果表明精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述實(shí)驗(yàn)方法稱取藥材0.601 1g制備樣品溶液，精密吸取10μL，每隔2h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣5次，RSD＝0.41，結(jié)果表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取杠板歸藥材粗粉0.25g，取已知含量的供試液1.0mL6份，分別加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.420mg／mL）1mL混合均勻，測定含量，其平均回收率為100.37%，RSD為0.78%（n＝6）。結(jié)果見表1。

表1 槲皮素加樣回收率 （n＝6）

3.8 樣品含量測定

分別于貴陽萬東橋藥品交易市場購得貴州產(chǎn)杠板歸藥材3批，每批藥材取3份樣品，依上法測定含量，結(jié)果見表2。

4 結(jié)語

4.1 指標(biāo)性成分的確定

由于國內(nèi)外對杠板歸尚未進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，基礎(chǔ)研究很不充分。杠板歸中缺乏能夠直接測定的有效成分或指標(biāo)成分，或含量太低。本實(shí)驗(yàn)以槲皮索含量為指標(biāo)成分，實(shí)驗(yàn)表明本方法快速、簡便、準(zhǔn)確，而且槲皮素本身具有祛痰、止咳、平喘作用，可作為杠板歸的質(zhì)量控制指標(biāo)成分。

表2 杠板歸藥材含量測定

4.2 色譜條件的確定

4.2.1 檢測波長的選擇

取槲皮素對照品溶液，通過紫外掃描，溶液在254nm、360nm兩個(gè)波長時(shí)有明顯吸收。通過雙波長色譜圖分析，最后選擇360nm作為測定波長，結(jié)果比較理想，峰形較好，干擾較少。

4.2.2 流動相的選擇考察

本實(shí)驗(yàn)用甲醇與0.2%磷酸（體積比45∶55）可將槲皮素與其他峰分離，且流動相配比簡單。在實(shí)驗(yàn)中曾考察了甲醇－0.2%磷酸不同比例（體積比55∶50、50∶50、45∶55）。結(jié)果表明，流動相比例除對保留時(shí)間有一定影響外，對槲皮素峰的分離和峰純度無明顯影響。

4.3 提取及水解條件的選擇

杠板歸藥材中的槲皮素有一部分以苷元形式存在的，要將杠板歸藥材中的槲皮素提取出來，在實(shí)驗(yàn)中對提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間、加酸量進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，確定采用20%鹽酸的乙醇溶液加熱回流提取2h時(shí)，提取率較高。

杠板歸藥材因特有的療效而廣泛應(yīng)用于臨床，但關(guān)于其質(zhì)量評價(jià)方法的報(bào)道極少，本實(shí)驗(yàn)為杠板歸藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供了一種簡便準(zhǔn)確的分析方法，值得推廣應(yīng)用。

［1］貴州省中藥材.民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［M］.貴州：貴州科技出版社，2003.

［2］謝輝，顧漢沖，許金宏.薄層掃描法測定杠板歸糖漿中槲皮素的含量［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，13（2）：88.