明目地黃丸微生物限度檢查方法學(xué)研究

張 萍，金建平

（蕪湖市食品藥品檢驗所，安徽 蕪湖241000）

明目地黃丸是由熟地黃、山茱萸（制）、牡丹皮、山藥、茯苓等12味中藥組方而成的復(fù)方制劑組成，輔料為煉蜜。主要功能為滋腎、養(yǎng)肝、明目。對其進行微生物限度檢查時，按照規(guī)定［1－2］必須進行方法驗證試驗，但在中國藥典收載的該品種檢查項下，未詳細規(guī)定具體的微生物限度檢查方法。根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2010年版一部附錄）微生物限度檢查法［2］，對明目地黃丸的細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法及控制菌的檢查方法進行驗證。通過試驗建立了該品種的微生物限度檢查方法，為藥品生產(chǎn)和檢驗監(jiān)督提供了一個可行有效的方法學(xué)參考。

1 實驗環(huán)境及材料

1.1 試驗環(huán)境

在環(huán)境潔凈度萬級、局部潔凈度百級的單向流空氣的無菌室中進行。

1.2 儀器

HH·B11·500型電熱恒溫培養(yǎng)箱、XL21型霉菌培養(yǎng)箱、數(shù)顯恒溫水浴鍋、YXQLS－50S數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器、電子天平。

1.3 驗證用菌種

大腸埃希菌［CMCC（B）44 102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26 003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63 501］、白色念珠菌［CMCC（F）98 001］、黑曲霉［CMCC（F）98 003］。以上菌種均購自中國藥品生物制品檢定所，實驗用菌種為其第二代培養(yǎng)物。

1.4 培養(yǎng)基及稀釋劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號：080519）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號：080313）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號：080527）、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基（批號：090105）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號：090226）、改良馬丁培養(yǎng)基（批號：080414），以上培養(yǎng)基均購自中國藥品生物制品檢定所。pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液（批號：090205），購自中國藥品生物制品檢定所、0.9%氯化鈉溶液（自配）。

1.5 樣品

明目地黃丸（蕪湖綠葉制藥有限公司，批號：100236）

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備［2，3］

接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18h，用0.9%無菌氯化鈉溶液分別稀釋制成1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。取25℃培養(yǎng)7d的黑曲霉改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，加0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子。吸取出1mL孢子懸液，然后用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋制成每1mL含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備［2］

取明目地黃丸（批號：100236）3份各10g，加45℃pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100mL，振搖溶解，作為1：10的供試液，備用。

2.3 細菌、霉菌和酵母菌檢查法的驗證試驗［2］

采用《中華人民共和國藥典》（2010年版一部附錄）微生物限度檢查法項下方法：細菌、霉菌和酵母菌用常規(guī)法進行3次獨立的平行試驗。菌液組：取1mL含50～100cfu試驗菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃，3天培養(yǎng)；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃，5天培養(yǎng)。每株試驗菌平行制備2個平皿，測定所加試驗菌數(shù)，觀察并記錄菌落數(shù)，菌落計數(shù)見表1。

試驗組：分別取試驗用的1：10供試液1mL和1mL含50～100cfu試驗菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃，3天培養(yǎng)；分別取試驗用的1：10供試液1mL和1mL含50～100cfu試驗菌（白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃，5天培養(yǎng)。每株試驗菌平行制備2個平皿，觀察并記錄菌落數(shù)，菌落計數(shù)見表2。

表1 菌液組菌落計數(shù) （cfu／mL）

表2 試驗組菌落計數(shù) （cfu／mL）

供試品對照組：取1：10明目地黃丸供試液1mL，加入平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)3天；取1：10明目地黃丸供試液1mL，加入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5天，每個稀釋級供試液平行制備2個平皿，按《中國藥典》2010年版一部微生物限度菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。菌落計數(shù)見表3，試驗組菌的回收率見表4。

表3 供試品對照組菌落計數(shù) （cfu／mL）

回收率計算：

表4 試驗組菌的回收率 （%）

稀釋劑對照組：取pH7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液1mL和1mL含50～100cfu試驗菌（大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉）的菌懸液，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，35℃，3天培養(yǎng)；白色念珠菌、黑曲霉傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，25℃，5天培養(yǎng)。每株試驗菌平行制備2個平皿，觀察并記錄菌落數(shù)，見表5，稀釋劑對照組菌的回收率見表6。

表5 稀釋劑對照組菌落計數(shù) （cfu／mL）

回收率計算：

表6 稀釋劑對照組菌的回收率 （%）

表4、表6數(shù)據(jù)表明，采用常規(guī)法進行計數(shù)時，試驗組和稀釋劑組的5種陽性試驗菌株的回收率均大于70%。

2.4 控制菌檢查方法的驗證試驗

2.4.1 大腸埃希菌驗證［2］

采用《中華人民共和國藥典》（2010年版一部附錄）微生物限度檢查法項下方法：大腸埃希菌用常規(guī)法進行驗證試驗。①試驗組：取1∶10的供試液10mL及10～100cfu試驗菌加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查；②陽性菌對照試驗：取56cfu的陽性對照菌大腸埃希菌加入到100mL膽鹽乳糖增菌液中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查；③陰性菌對照組：取1∶10的供試液10mL及陰性對照菌金黃色葡萄球菌70cfu，加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法檢查；④陰性對照試驗：取稀釋劑10mL加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)；⑤供試品組：取1∶10的供試液10mL加入到100mL膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進行檢查。

取上述各組培養(yǎng)物0.2mL，接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)培養(yǎng)，于5h、24h在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照，觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液觀察。結(jié)果見表7（表中“＋”表示反應(yīng)呈陽性，“－”表示反應(yīng)呈陰性）。

表7 大腸埃希菌驗證結(jié)果

2.4.2 大腸菌群的驗證［2］

①陽性菌對照組：取1mL含菌量為10～100cfu／mL的大腸埃希菌對照菌液加入到10mL乳糖膽鹽發(fā)酵管中，于35℃培養(yǎng)24h；②供試品組：取1mL 1：10的杞菊地黃丸（濃縮丸）供試液加入到10mL乳糖膽鹽發(fā)酵管中，于35℃培養(yǎng)24h；③試驗組：取含菌量為10～100cfu／mL的大腸埃希菌對照菌液1mL和1mL 1：10的供試液加入到10mL乳糖膽鹽發(fā)酵管中，于35℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)果見表8。

表8 大腸菌群驗證結(jié)果

結(jié)果顯示，陽性菌生長良好，表明供試品在該實驗條件下對大腸菌群的代表菌大腸埃希菌無抑菌作用，說明可以采用此方法進行本品的大腸菌群檢查。

3 實驗結(jié)果及討論

3.1 細菌數(shù)、霉菌、酵母菌計數(shù)及驗證結(jié)果

由表4及表6的驗證結(jié)果可以看出，試驗組菌的回收率和稀釋劑對照組菌的回收率均大于70%，說明可以采用常規(guī)的平皿計數(shù)法進行明目地黃丸的細菌、霉菌及酵母菌限度檢查，方法符合《中國藥典》2010年版一部的相關(guān)要求。

3.2 控制菌檢查方法驗證結(jié)果

試驗組、陽性菌對照組均呈陽性，陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌。試驗組呈陽性表明試驗菌能夠正常生長，陰性菌對照組未檢出陰性菌，表明試驗菌對其相對應(yīng)的增菌液具有專屬性并且供試品在上述實驗條件下對大腸埃希菌無抑菌作用。因此，明目地黃丸控制菌檢查可采用常規(guī)法。

3.3 微生物限度檢查方法的建立

根據(jù)上述實驗結(jié)果，明目地黃丸微生物限度檢查方法為：照微生物限度檢查法（《中國藥典》2010年版一部附錄），取本品10g，加入45℃的pH 7.0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，振搖使分散均勻，作為1∶10供試液。細菌、霉菌和酵母菌計數(shù)按常規(guī)平皿法測定；控制菌按常規(guī)法檢查，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。

［1］國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：附錄70－79.

［2］國家藥典委員會.中國藥典［S］.二部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：附錄79－88.

［3］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗手冊［M］.第1版.北京：科學(xué)出版社，2000：62.