養心顆粒對犬心肌梗死后心臟局部自主神經的影響

李晶潔，于彥偉，王召軍，馮薇，周亞濱

(1.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150001;2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

20年來大量的臨床實踐證明，心肌梗死(MI)后自主神經功能嚴重失調，且與患者的預后密切相關。有研究表明，MI后交感神經激活的機制與心臟局部感受器的反射控制相關，可能是MI導致來自心臟局部感受器的反射受損，使交感傳出活性受到抑制，但目前對MI后心臟局部交感神經損傷及再生機制的研究很少。本研究應用免疫組織化學技術定量研究MI后心臟局部交感神經分布情況，觀察中藥養心顆粒對心臟局部交感神經損傷及再生過程的影響，以探討其改善MI后自主神經功能失調的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備及分組

成年健康雜種犬21只，雌雄不拘，體質量14～22kg，隨機分為假手術對照組、MI組與MI+養心顆粒組(MI后每天給予養心顆粒2.53g/kg)各7只。3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉，氣管插管接人工呼吸機。在無菌條件下，沿左側第4肋間開胸，在冠狀動脈前降支分出第1對角支的近端，用0號線結扎冠狀動脈前降支造成左心室前側壁心肌梗死。假手術組開胸不結扎冠脈。術后三組動物均正常飲食喂養4周。

1.2 養心顆粒藥物制備 將黃芪50g，人參15g，茯神15g，茯苓 15g，半夏 15g，當歸 15g，川芎15g 等 13 味中藥，加10倍量水浸泡2h，煎煮2h，過濾后加8倍量水，煎煮1.5h，過濾后加6倍量水煎煮1h，過濾。將3次濾液合并，減壓濃縮至相對密度1.3(60℃)，每克浸膏含生藥 2.86g。按 2.53g/kg喂食，每日 1次，連續2周。

2 免疫組化測定交感神經重構情況

2.1 標本的取材及固定

活體快速取下心臟，以房室溝為界剪去心房及心底部其它組織，在左心室梗死區旁距梗死邊緣約0.5cm的非梗死區取材，取材按左室長軸方向，取材后立即投入4%多聚甲醛固定液中，固定24～48h。石蠟包埋、切片，片厚4～5μm。每例測兩張切片。

2.2 交感神經支配密度的測定方法

心肌中交感神經支配區域為洛氨酸羥化酶(TH)陽性染色區域，TH染色陽性神經纖維由Motic Images Advanced 3.2軟件及專用顯微鏡組成的計算機圖像處理系統進行檢測。每張玻片在40×物鏡下進行檢測。依據陽性免疫反應的圖像選擇合適的分割閾值，實現單點生長分割。以人機交互方式測定梗死區旁非梗死區的神經纖維密度。神經密度通過TH陽性纖維在選區中所占的面積表示(um2/mm2)，其中陽性纖維的面積以um2表示，選取面積以mm2表示。每張玻片中，6個包含最多神經結構視野的神經密度的平均值代表該玻片的神經密度。

2.3 數據處理及統計學檢驗

所有數據輸入計算機，應用SPSS 11.5軟件分析。結果以均值±標準差表示，兩組之間的差異比較應用t檢驗，兩樣本率的比較采用χ2檢驗。其中P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

3 結果

假手術對照組中，心肌細胞之間均可見TH免疫染色陽性的神經纖維分布，神經纖維主要分布在心內膜下、心外膜下及血管旁，其走行與心肌細胞方向一致。

心肌梗死組中，在兩只犬檢測到酪氨酸羥化酶免疫染色神經纖維密度明顯增高區，顯示該局部神經增生活躍。該組其它各犬檢測到的神經密度亦明顯高于對照組，且神經走行紊亂。

心肌梗死+養心顆粒組中，神經密度雖高于對照組，但較心肌梗死組密度明顯降低，差異有統計學意義，且在該組中未檢測到神經纖維密度異常增高區。見表1。

表1 各組犬梗死灶周邊區交感神經支配密度(um2/mm2，±s)

表1 各組犬梗死灶周邊區交感神經支配密度(um2/mm2，±s)

注:相同部位與對照組比較，*P＜0.01;相同部位與心肌梗死組比較，#P ＜0.01。

組別 絡氨酸羥化酶正常對照組2 917.71 ±190.99心肌梗死組 3 779.86 ±286.57*心肌梗死 +養心顆粒組 3 134.48 ±265.27#

4 討論

近年自主神經逐漸被認識到是心律失常發生和持續的一個重要因素，心律失常與自主神經功能紊亂有著必然的聯系，主要證據有:大多數心源性猝死存在晝夜差異，其發病高峰時間恰與交感神經興奮性增高的時間相吻合，且精神因素是強烈的誘發條件。大規模臨床實驗證明，β受體阻滯劑可大大減少心肌梗死患者的猝死率［1］，這為自主神經維持心肌電活動穩定性所起的重要作用提供了有力佐證。但過去對這方面的認識多集中在交感神經興奮增加心肌組織的易損性上，近年發現，心肌梗死后心臟局部自主神經發生復雜的結構和功能改變，很可能通過影響心臟電生理穩定性參與功能性折返和室性心律失常。

有研究發現，交感神經對缺血的耐受性很差。在不伴有心肌梗死的冠心病病人中，自主神經已存在分布異?，F象［2］。動物實驗中，由冠脈狹窄造成的心肌頓抑可引起自主神經的分布明顯減少［3］，這說明神經比心肌細胞對缺血的耐受性更差，如果缺血持續40min以上，心肌的神經就會發生結構變化。MI后1～6周(尤其3～4周)，梗死區周邊去甲腎上腺素含量先是減少后有所恢復［4］，這說明MI后心臟局部交感神經有動態變化。酪氨酸羥化酶(TH)是兒茶酚胺生物合成的限速酶，交感神經的末梢軸索中含有大量的TH，它的存在標志著交感神經結構及功能的完整。本研究通過應用抗TH的免疫組織化學方法，檢測心臟中交感神經分布，證明MI組與正常對照組相比存在顯著的交感神經分布不均現象，特別在2只犬梗死區周邊的非梗死區檢測到交感神經密度顯著增高區，呈叢狀分布，神經排列不規則，這說明該部位有交感神經再生現象。有研究表明，在體外交感神經培養時，慢性神經刺激能夠導致TH表達增強、兒茶酚胺產生增加［5－6］。我們通過在體研究證明，心肌梗死后心肌中存在交感神經再生現象。養心顆粒是以益氣養心安神為原則組成的中藥復方制劑［7］，在多年的臨床工作中，應用養心湯作為主方進行加減治療不穩定型心絞痛，取得了較好的療效，同時還降低心律失常的發生機率。本研究應用養心顆粒干預心肌梗死犬，發現其有抑制心肌梗死后心臟局部交感神經過度再生機制，從而為其降低心律失常發生率提供理論依據。

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