中風1號湯劑對急性腦出血大鼠NSE蛋白水平影響及改善神經功能缺損的實驗研究

梁群，朱永志，楊瀅，于倩，郝娟，劉茜

(1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦出血，屬于中醫學中出血性中風范疇，是嚴重危及人類生命健康的常見病、多發病，其患病率、致殘率及病死率均較高，為患者家庭帶來經濟上和精神上雙重的負擔［1－2］。近年來，腦出血具有年輕化及逐年上升趨勢。西醫對腦出血的內科治療主要集中在對癥支持療法上，如防治腦水腫、降低顱內壓等等，但長期預后效果并不理想。近年來，中藥干預治療腦出血的研究取得了可喜的成績［3］，本研究通過觀察中風1號湯劑對大鼠急性腦出血神經缺損功能及腦水腫癥狀的改善，及中藥干預前后血清NSE濃度的變化，初步探討中醫藥治療急性腦出血的療效，從而為今后的中西醫結合內科保守治療提供一定的參考。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，體質量(250±20)g，雄性，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提拱，按清潔級標準飼養。

1.2 主要儀器及試劑

大鼠腦立體定位儀(型號:TSE，德國進口);電熱鼓風干燥箱(型號:CS101－2E，中外合資重慶四達實驗儀器有限公司);電子天平，低速臺式離心機(型號:TDL－80－2B，上海安亭科學儀器廠);10%水合氯醛溶液(天津市福晨化學試劑廠);大鼠神經特異性烯醇化酶(NSE)ELISA檢測試劑盒(美國R＆D Systems);30%過氧化氫;聚維酮碘溶液;100ul微量注射器。

1.3 藥物

中風1號湯劑主要由黃芪，當歸，川芎等中藥配伍而成(由黑龍江中醫藥大學附屬一院提供的院內制劑);20%甘露醇(石家莊四藥有限公司，規格:250ml/瓶，國藥準字H1302303);肝素鈉注射液(江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，規格:12 500U/2ml，2ml×10支，批號0705105);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司，規格:160萬u/瓶，批號D0804310)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組

將50只雄性Wistar大鼠隨機分為5組，每組10只，即中藥組(中風1號組)、西藥組(甘露醇組)、中西藥聯合組(中風1號聯合甘露醇組)、假手術組、空白組。假手術組為對照組。分別觀察各組動物用藥前后神經功能缺損情況，以及第5天血清NSE水平的變化，并測定腦組織含水量。

2.2 造模

制備大鼠急性腦出血模型［4］。

1 )麻醉并固定:大鼠稱取質量，用10%水合氯醛，以0.4uL/1g腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定向儀上;2)定位:備皮，局部消毒。正中縱行切口，30%雙氧水腐蝕骨膜暴露前囟及進針點。靶點定位于前囟為0點、中線左側旁開3mm、前囟后0.4mm，進針點處用牙科鉆鉆一個直徑1mm圓孔至硬膜表面，勿鉆通硬腦膜;3)取血及注血:剪尾取血，用微量進樣器抽取血量67μL(因大鼠腦出血 1μL相當于人腦出血0.75mL，故上述出血量分別相當于人腦出血50mL)。血液靜置5min使之半凝固。針頭通過鉆孔垂直緩慢進入腦內，并將凝固血快速注入靶點內(注射速度20μL/min)，并留針30min，拔針。局部涂用注射用青霉素鈉，并縫合刀口。同時腹腔注射青霉素鈉20萬U，連續應用5天，防止術后感染而影響實驗結果。

假手術組:造模方法同上，但是不向腦內注射血。

2.3 給藥

大鼠的用藥量按成人劑量與人體質量折算系數比公式計算［5］。

中藥組:中風一號湯劑，1.5ml灌胃，2次/天。生理鹽水1g/kg，2次/天股靜脈注射。術后持續給藥5天;西藥組:生理鹽水，1.5ml灌胃，2次/天。甘露醇1g/kg，2次/天股靜脈注射。術后持續給藥5天;中西藥結合組:中風一號湯劑，1.5ml灌胃，2次/天。甘露醇1g/kg，2次/天股靜脈注射。術后持續給藥5天;假手術組:生理鹽水，1.5ml灌胃，2次/天。生理鹽水1g/kg，2次/天股靜脈注射。術后持續給藥5天;空白組:生理鹽水，1.5ml灌胃，2次/天。生理鹽水1g/kg，2次/天股靜脈注射。術后持續給藥5天。

2.4 造模成功評分

在所有動物麻醉完全清醒后(約術后3h)，參照Zea－Longa方法［6］進行各組大鼠神經功能缺損評分(Neurological deficit score，NDS)，分為5 分:

0 分:正?；顒?，無神經功能缺損;1分:將大鼠尾巴提起，癱瘓側前肢不能充分伸展;2分:大鼠有向癱瘓側偏轉的行為;3分:向癱瘓側傾倒;4分:不能行走，有意識障礙。

2.5 樣品采集及血清NSE檢測

10%水合氯醛麻醉，剖腹，腹主動脈取血4ml，并離心，參照說明書，采用酶聯免疫分析法測定血清NSE水平。

2.6 腦組織含水量測定

10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，開顱取腦，生理鹽水沖洗后用濾紙吸盡腦表面血漬和水分，取出血灶周圍約3mm腦組織置于電子天平上稱濕重并記錄，再將標本置于100℃恒溫箱烘烤1天后再稱干重。并按照Elliot公式計算:腦組織含水量(%)=(濕重－干重)/濕重×100%。

2.7 統計學處理

采用SPSS 13.0醫學統計軟件進行分析，實驗數據用均數加減標準差(±s)表示，組間數據比較用方差分析。

3 實驗結果

3.1 神經功能缺損評分

從表1可以看出，各組與假手術組比較，均有顯著性差異(P＜0.01);前四組組間內比較無統計學意義(P＞0.05)，說明造模成功。

從表2可以看出，術后第5天，各組與假手術組比較，均有顯著性差異(P＜0.01);各組與空白組比較，具有顯著性差異(P＜0.01)，空白組NDS明顯高于其他組;中藥組、西藥組與中西醫結合組比較，具有顯著性差異(P＜0.05);單純中藥組與單純西藥組比較，無統計學意義(P＞0.05)。

表1 術后0天大鼠NDS評分(±s)

表1 術后0天大鼠NDS評分(±s)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01。

NDS中藥組 9 2.43 ±1.023組別n＊＊西藥組 8 2.39 ±0.990＊＊中西醫結合組 9 2.42 ±0.963＊＊空白組 9 2.40 ±0.680＊＊假手術組10 0.00 ±0.00

表2 術后5天大鼠NDS評分(±s)

表2 術后5天大鼠NDS評分(±s)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△△P＜0.01;與中西醫結合組比較，#P＜0.05。

NDS中藥組 9 2.10 ±1.023＊＊△△#組別n 10 0.00 ±0.00西藥組 8 2.08 ±0.982＊＊△△#中西醫結合組 9 1.79 ±1.245＊＊△△空白組 9 3.27 ±0.530＊＊假手術組

3.2 血清NSE水平測定

從表3可以看出，術后第5天，各組與假手術組比較，均有顯著性差異(P＜0.01);各組與空白組比較，具有顯著性差異(P＜0.01)，空白組NSE水平明顯高于各組;中藥組、西藥組與中西醫結合組比較，具有顯著性差異(P＜0.01);單純中藥組與單純西藥組比較，無統計學意義(P＞0.05)。說明中藥組與西藥組均可降低NSE含量，但兩者之間無差異，而中西醫結合組NSE含量顯著降低，說明中西醫結合組能有效減輕出血性中風大鼠急性期神經元損傷，并有改善預后作用。

表3 術后5天大鼠血清NSE水平(±s)

表3 術后5天大鼠血清NSE水平(±s)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與空白組比較，△△P＜0.01;與中西醫結合組比較，##P＜0.01。

NSE中藥組 9 19.07 ±2.62＊＊△△##組別n 10 6.34 ±1.31西藥組 8 18.29 ±2.59＊＊△△##中西醫結合組 9 12.82 ±1.72＊＊△△空白組 9 24.13 ±2.16＊＊假手術組

3.3 腦組織含水量測定

從表4可以看出，術后第5天，各組腦組織含水量與假手術組比較，均有顯著性差異(P＜0.05);各組與空白組比較，也具有顯著性差異(P＜0.05)，尤其是中西醫結合組(P＜0.01)，說明空白組腦組織含水量明顯高于各組;中藥組、西藥組與中西醫結合組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)，說明中西藥結合組能明顯降低腦組織含水量;單純中藥組與單純西藥組比較，無統計學意義(P＞0.05)。

表4 術后5天大鼠腦組織含水量(±s)

表4 術后5天大鼠腦組織含水量(±s)

注:與假手術組比較，*P＜0.05;與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與中西醫結合組比較，#P＜0.05。

組別 n 腦含水量(﹪)中藥組 9 79.42 ±0.89＊△#10 77.24 ±0.42西藥組 8 79.35 ±0.77＊△#中西醫結合組 9 78.76 ±1.72＊△△空白組 9 83.35 ±0.54*假手術組

4 討論

烯醇化酶是參與糖酵解的關鍵酶，其普遍存在于生物體內的糖酵解代謝中，尤其是γγ型同功酶，其特異地存在于神經元和神經內分泌細胞內，故又稱為神經元特異性烯醇化酶(NSE)［7］，正常條件下，NSE特異性地存在于神經元細胞漿內，當缺氧、缺血或中毒的情況下，神經元細胞膜的完整性遭到破壞，使NSE從細胞內漏到細胞外，進入細胞間隙，并進入腦脊液，再透過血腦屏障進入血管內，從而進入血液循環［8］。因此，有的學者認為，腦脊液和血清NSE水平可用來判斷急性期腦出血病情程度及預后［9］。

腦水腫是腦出血的重要并發癥，也是臨床急性腦血管疾病病情加重和死亡的主要原因。腦出血引起顱腦損傷的機制中，腦組織水腫引起顱內壓異常升高是首要因素，因此西醫內科保守治療急性腦出血，脫水降顱內壓是最重要原則。所以，腦組織含水量的測定有對于判斷藥物治療效果以及患者病情發展情況非常有意義。

中風1號是由黃芪、當歸、川芎等中藥配伍而成，具有益氣活血，祛瘀通絡，扶正之功效，是朱永志教授治療急性腦出血臨床經驗的總結，是緩解急性期腦出血癥狀并改善患者預后的有效中藥。

本研究顯示，中風1號湯劑組，西藥組及中西醫結合組均對大鼠腦出血性損傷引起的神經功能缺損及腦水腫有明顯改善作用，且能夠明顯降低血清NSE水平，尤其是中西醫結合組，效果非常顯著(P＜0.01)，而單純中風1號湯劑組與單純西藥組比較，無統計學意義(P＞0.05)。推測其機制可能與中藥改善腦出血后腦血流動力學，維護血腦屏障正常的通透性，穩定神經元細胞膜，減少組織滲出，減輕腦水腫及NSE的釋放，從而具有保護神經組織，改善患者預后的作用。

［1］ 朱慧淵.運用“治未病”理論防治腦中風探析［J］.中醫藥學報，2010，38(6):6 －8.

［2］ 鈔建峰，賈慧，孫風平.試述以“虛”為核心的中風病機觀［J］.中醫藥學報，2011，39(2):67 －68.

［3］ 張友堂，陳磊.續命湯治中風新解［J］.中醫藥學報，2010，38(5):103.

［4］呂田明，陸兵勛.大鼠尾狀核注射凝固自體動脈血腦出血模型［J］.中風與神經疾病雜志，2006，23(1):88－90.

［5］ 陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛生出社，1993:33－35.

［6］ Zea longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversibal middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20:84－91.

［7］ 關景霞，余紹祖，曾慶杏.神經元特異性烯醇化酶和S－100蛋白在腦血管疾病中的臨床意義［J］.國外醫學·腦血管疾病分冊，2000，8(4):242 －244.

［8］ Barone FC，Clark RK，Price WJ，et al.Neuron － specific enolase in creases in cerebral and systenic circulation following focal insche mia［J］.Brain Res，1993，623:77 －82.

［9］ Schaarsschmidt H，Prange HW，Reiber H.Neuron specific enclose concentrations in blood as a prognostic parameter in cerebrovas cular diseases［J］.Stroke，1994，25(6):558 －565.