水蛭水煎醇沉工藝的正交設計研究

于棟華，張穎，徐紅英，于純淼

(1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

水蛭(Hirudo)為水蛭科動物螞蟥的干燥全體，是傳統中藥材，具有破血、逐瘀、通經之功效［1］。水蛭藥性峻猛，是常用的破血藥。國內以寬體金線蛭為主流商品［2］，臨床上多用此類水蛭?，F代研究表明，水蛭在抗凝血、抗血栓形成等方面表現出強烈的生物活性，可用于心腦血管疾病的治療［3］。水蛭中有效成分水蛭素(Hirudin)是一種非常穩定的抗凝血蛋白質。研究表明［4］，水蛭素性質穩定，單純溫度升高(100℃水浴)和pH值的改變(1～13)不影響其活力。只有當溫度和pH值同時升高時其活力才開始下降，在pH=13的條件下經80℃處理15min即完全失活。水蛭素與凝血酶的親和力極強，1μg水蛭素可中和5μg凝血酶，相應摩爾比為1∶1，即中和一個國際單位(NIH單位)的凝血酶需要一個抗凝單位(lAT－μ)的水蛭素［5］。

作者通過預實驗得出單純的水煎或單純醇提效果都不如水提醇沉的抗凝效果好。故采用水提醇沉的方法對水蛭進行提取。以雙縮脲比色法結合凝血酶滴定法計算其比活力為指標，考察煎煮時間、乙醇濃度、醇沉時間和加水量對水蛭提取物的影響，選擇最佳工藝路線，并確定水蛭提取制備工藝。

1 實驗材料和儀器

寬體金線蛭(山東水產養殖中心);纖維蛋白原(美國Sigma公司);凝血酶(美國Sigma公司);牛血清白蛋白(美國Sigma公司);雙縮脲試劑(上海榮盛生物技術有限公司);Tris堿;95%乙醇;旋轉蒸發儀;離心機;水浴鍋。

2 實驗方法

2.1 水蛭素含量的測定—凝血酶滴定法［6］

取纖維蛋白原0.25g，溶于50mL的Tirs－HCl緩沖液(pH值≈7.4)中，得0.5%的纖維蛋白原溶液。稀釋凝血酶到5NIH/mL。取200μL纖維蛋白原溶液，加入100μL水蛭提取液，并滴加凝血酶，當出現膠凍狀凝塊時即為滴定終點，從滴定的凝血酶用量即可推算出待測樣品中的水蛭素的活力單位數。

2.2 水蛭素蛋白含量測定—雙縮脲法

取一系列試管分別加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL標準牛血清白蛋白溶液(6mg/mL)，用水補足至2mL，在37℃下分別加入4mL雙縮脲試劑，用分光光度計在540nm處測定其吸光度，吸光度(A)分別為0.000、0.099、0.200、0.304、0.399、0.500。以 A 為縱坐標，牛血清白蛋白含量(C)為橫坐標繪出標準曲線(見圖1)。其線性方程為 A=0.041 7c+0.000 05(R=0.999 9)。取圖1雙縮脲比色法測蛋白含量標準曲線2.0mL待測樣品按上述方法測及吸光度。計算蛋白質含量。

圖1 標準曲線

用測得的蛋白質含量結合用凝血滴定法測得的數據，可求出待測樣品中水蛭素的比活力:比活力(ATU/mg)=水蛭素的活力單位數/蛋白含量。

3 正交實驗優選提取工藝

3.1 因素水平表 見表1。

表1 因素水平表

3.2 正交實驗方法及數據

將水蛭藥材粉碎成粗粉，稱取10g，共9份，按表2中L9(34)設計方法分別提取。提取液過濾，濃縮至50mL，按表2進行醇沉后，醇沉液離心取上清液，回收乙醇濃縮至50mL。

表2 正交實驗設計表及結果

直觀分析表明，以水蛭素比活力為標準，在所選因素水平范圍內，四因素影響大小順序為D(醇沉時間)＞A(煎煮時間)＞C(醇沉濃度)＞B(加水量)，最佳提取條件為A2B1C3D2，即水蛭粗粉加(20+10)倍水煎煮(60+30)min后，提取液80%乙醇醇沉24h。

3.3 驗證實驗

分別稱取3份水蛭粗粉，按優選工藝A2B1C3D2，重復提取3次，得平均比活力為38.357 ATU/mg，RSD=2.33%，表明試驗所確定的最佳工藝為較優工藝。

4 結論

水蛭素的檢測方法還未有統一的標準，目前以單一方法檢測水蛭素優選水蛭提取工藝實驗較多。本實驗過程利用了水蛭素和凝血酶Ⅱ的配比關系測定不同條件水蛭提取液的水蛭活力單位數，并結合蛋白質含量的測定，以水蛭素比活力為標準，確定了水蛭提取的最佳條件。此方法有較好的準確性。實驗結果表明，(20+10)倍水煎煮(60+30)min后，提取液80%乙醇醇沉24h條件最佳。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.北京:化學工業出版社，2005:57.

［2］ 呂文海，公素琴，杜征國，等.水蛭飲片規格質量的調查及實驗研究［J］.中國中藥雜志，1995，20(11):665 －668.

［3］ 董曉云，饒高雄，林亞明，等.以抗凝血活性指標篩選水蛭的提取工藝［J］.云南中醫學院學報，2002，25(3):23 －25.

［4］ 周進科，劉翠萍.凝血酶抑制劑－水蛭素［J］.中國新藥雜志，1997，6(3):186.

［5］ 于秉新，李愛君，邵民象.水蛭開發與臨床應用［J］.時珍國醫國藥，2000，11(2):179 －180.

［6］ 陳華友，邢自力，李媛媛，等.凝血酶滴定法測定水蛭素活性的改進［J］.生物技術，2002，12(6):24 －25.