刺五加注射液致敏性物質篩選的初步研究

馮宇飛，王艷宏，邢希旺，呂邵娃，劉筱清，李永吉

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

刺五加注射液具有擴張血管、增加冠狀動脈血流量、減少心肌耗氧量、降低血黏度、改善血液循環、提高機體免疫力和應激功能等功效［1］，并有良好的鎮靜作用，能明顯地改善睡眠、增進食欲，還能清除氧自由基、提高人體過氧化物歧化酶、促進蛋白質合成和組織修復。臨床用于治療短暫性腦缺血發作、腦動脈硬化、腦血栓形成和腦栓塞、冠心病、心絞痛、神經衰弱、更年期綜合征、頸椎病和糖尿病下肢血管病變等［2－3］。隨著臨床應用的日益廣泛，對其所致的各種不良反應屢有報道，嚴重的可導致過敏性休克［4］。因此，查明刺五加注射液過敏原因，篩選出刺五加注射液的致敏物質，是解決刺五加注射液安全性的根本所在。本研究采用體內外方法同時對刺五加注射液的過敏性進行了評價，并對刺五加注射液的致敏部位進行了初步篩選，為本課題組的后續實驗奠定基礎。

1 材料

1.1 藥品與試劑

臨床有過敏反應的刺五加注射液(批號20100309、20100702、20100907);弗氏完全佐劑(sigma公司);弗氏不完全佐劑(sigma公司);生理鹽水(哈爾濱三聯藥液有限公司，批號101124A5);組胺二鹽酸鹽(廣州市齊云生物技術有限公司);Pereoll分離液(Amresco公司);臺盼蘭(Sigma公司);鄰苯二甲醛(國藥集團化學試劑有限公司);正丁醇(天津津東天正精細化工有限公司);正庚烷(天津市富宇精細化工有限公司);三氯乙酸(武漢市合中生化制造有很公司);伊文思蘭(sigma進口分裝);卵白蛋白(sigma進口分裝)。

1.2 實驗動物

SD大鼠，雄性，體質量(200±20)g，由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供，合格證號為SCXK(黑)2008004號。

2 實驗方法

2.1 PCA試驗判斷刺五加注射液的致敏性

2.1.1 分組

SD大鼠，隨機分為5組，分別為陽性藥卵白蛋白組、刺五加注射液組(批號 20100309、20100702、20100907)、生理鹽水組，每組6只。

2.1.2 致敏及抗血清的制備

經本課題組對PCA試驗的各影響因素進行優化后，建立了靈敏、可靠的PCA試驗方法，采用優化后的PCA方法，將各組實驗藥物與弗氏佐劑混合后的乳劑分別注射于背部皮內四點，隔日1次;共免疫3次，末次致敏后 15天，大鼠眼眶取血，室溫自然凝固，6 000rpm、離心20min，分離血清并按組合并，置－20℃冰箱備用。

2.1.3 激發

另取SD大鼠30只，按照被動致敏時注射的抗血清不同隨機分為5組，每組6只，將其背部脫毛，同時準備各組血清的生理鹽水稀釋液(1∶2、1∶8、1∶32)和血清原液備用。在大鼠脊柱兩側各取兩點，共四點，每點皮內注射一種血清原液或是血清生理鹽水稀釋液，每點注射0.1ml。24h后，靜脈注射抗原藥物和伊文思蘭的混合液。抗原激發30min后，放血處死大鼠，剪取并翻轉背部皮膚，測定藍斑直徑，并拍照留存，藍斑直徑在5mm以上者判定為試驗陽性，5mm以下者判定為試驗陰性。

2.2 致敏大鼠腹腔肥大細胞內外組胺總量的測定

2.2.1 肥大細胞的分離、純化

將PCA試驗中各組致敏大鼠，放血處死，制備腹腔肥大細胞懸液，在4℃實驗條件下，根據密度梯度分離的原理，采用不同密度的細胞分離液Percoll對肥大細胞進行分離、純化，鏡下計數，調細胞濃度至1×105個/ml。

2.2.2 肥大細胞處理

離心管中加入450ul的肥大細胞懸液后分別加入臺氏液200ul和對應抗原200ul。37℃下孵育10min，孵育完成將細胞離心取上清，得細胞外液。沉淀物加入0.8ml的臺氏液混勻煮沸10min，使細胞破裂，離心取上清，得細胞內液。

2.2.3 肥大細胞組胺測定

取處理后的樣品1.6ml置于已加NaCl的試管中，再加入正丁醇和NaOH溶液，立即混勻、震蕩。然后取出正丁醇相加入到含HCl溶液和正庚烷的試管中，震蕩。棄有機相，HCl相置入試管中。

HCl相用三蒸水稀釋1倍，加入NaOH溶液，混勻并迅速加入鄰苯二甲醛的甲醇溶液，立即混勻，并在21℃ ～22℃反應10min，加入HCl溶液酸化，以終止縮合反應并使熒光物質穩定，測熒光值(激發波長350un，發射波長442nm)。試劑空白以三蒸水代替處理后的樣品。

2.3 PCA試驗對刺五加注射液致敏物質的初步篩選

將批號為20100702的刺五加注射液采用85%乙醇進行沉淀，分別獲得沉淀與上清兩部分，另取空白SD大鼠12只，分為2組，每組6只，將2.1.2項下所得的抗血清按生理鹽水稀釋液(1∶2、1∶8、1∶32)和血清原液進行背部注射致敏，每點注射0.1ml。24h后，上述兩組大鼠分別靜脈注射刺五加注射液的醇沉產物與上清和伊文思蘭的混合液進行激發。激發30min后，放血處死大鼠，剪取并翻轉背部皮膚，測定藍斑直徑，并拍照留存，藍斑直徑在5mm以上者判定為試驗陽性，5mm以下者判定為試驗陰性。

3 實驗結果

3.1 大鼠被動皮膚過敏實驗(PCA)

大鼠被動皮膚過敏實驗 實驗數據見表1，圖1～4。

表1 刺五加注射液大鼠被動皮膚過敏試驗結果(±s)

表1 刺五加注射液大鼠被動皮膚過敏試驗結果(±s)

組別n 血清稀釋度(藍斑直徑:mm)6 0 0 0 0 0卵白蛋白組 6 10 8 3 0 100刺五加(20100309) 6 4 0 0 0 0刺五加(20100702) 6 8 3 0 0 66.7刺五加(20100907) 6 2 0 0 0 0 20100702 醇沉產物 6 7 2 0 0 66.7原液 1∶2 1∶8 1∶32 原液陽性反應率(%)空白組20100702上清液 6 0 0 0 00

圖1 空白組

圖2 卵白蛋白陽性對照組

圖3 刺五加批號20100702沉淀組

圖4 刺五加批號20100702組

實驗結果顯示:刺五加注射液(批號20100702)、刺五加注射液85%醇沉產物，卵白蛋白組，原液斑點直徑均大于5mm，呈現陽性結果，生理鹽水組、刺五加注射液(批號20100309、20100907)均呈現陰性結果，經改良后的被動皮膚過敏試驗可以較為靈敏的檢測刺五加注射液的過敏性。

3.2 腹腔肥大細胞內外組胺量測定結果

不同批次刺五加注射液對致敏大鼠腹腔肥大細胞組胺量的影響見表2，經統計學分析表明，PCA試驗中陽性過敏批次20100702與兩空白對照組及批次20100309、20100907相比較均具有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 刺五加注射液致敏后大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放量(±s)

表2 刺五加注射液致敏后大鼠腹腔肥大細胞組胺釋放量(±s)

注:與空白組比較，*P＜0.05;與 20100309和20100907比較，*P ＜0.05。

批次 20100309 20100702＊＊ 20100907空白組1 1.10 ±0.11 2.85 ±0.50*0.80 ±0.19 0.46 ±0.07 0.17 ±0.03 0.57 ±0.01 2 1.35 ±0.30 2.78 ±0.61* 0.25 ±0.05 0.57 ±0.02 3 1.38 ±0.01 2.42 ±0.74* 0.61 ±0.10 0.52 ±0.13 4 1.26 ±0.41 3.30 ±0.85* 0.38 ±0.08 0.51 ±0.09 5 2.44 ±0.52 2.76 ±0.63* 0.45 ±0.10 0.53 ±0.10 6 2.16 ±0.16 2.96 ±0.45*

4 討論

建立一個靈敏、可靠的過敏實驗判斷方法是現階段進行中藥注射劑致敏物質篩選的前提條件，PCA是根據P－K試驗原理發展而來，其基本原理:將致敏動物血清(內含豐富IgE抗體)皮內注射于正常動物。IgE與皮膚肥大細胞的Fcз受體結合，使之被動致敏。當致敏抗原激發時，引起局部肥大細胞釋放過敏介質，從而使局部血管通透性增加，注入染料可滲出于皮丘，形成一個藍斑。根據藍斑范圍，判定過敏反應程度。PCA是一種較佳的鑒定抗原抗體反應的體內法。目前有更多的體外法如酶聯及放免等方法，然而在某些情況下，特別是動物實驗條件下體內法是很有意義的，本研究將PCA試驗進行改良后作為刺五加注射液過敏性實驗體內試驗方法，同時采用經典的組胺測定方法—熒光分光光度法測定致敏大鼠腹腔肥大細胞組胺量，從而判斷刺五加注射液的過敏性，經優化后的PCA試驗為進一步對刺五加注射液的致敏原因進行分析，查找其致敏物質，保證刺五加注射液在臨床上的安全應用奠定了實驗基礎。

通過將刺五加注射液按照原有工藝進行醇沉所得的沉淀產物與上清液的致敏性進行判斷，初步判斷致敏物質可能存在于醇沉產物中，這與其他的文獻［5－6］報道中表述抗原物質可能為大分子蛋白類物質相符，但目前還不能排除其他高分子物質以及小分子半抗原作為致敏物質存在的可能性，因此，本課題組在此研究基礎上，將進一步對刺五加注射液的致敏物質進行篩選以及致敏機制進行深入研究，找到刺五加注射液的致敏原因，確保刺五加注射液的安全性，保障臨床用藥的需要。

［1］ 王劍，廖林.158例刺五加注射液不良反應調查分析［J］.中醫中藥，2009，6(21):91 －93.

［2］ ＇范麗靜，蔣曉紅，姚國恩.刺五加注射液研究進展［J］.中成藥，2003，25(6):488.

［3］ 董梅，李廷利.刺五加化學成分及藥理作用研究進展［J］.中醫藥學報，2011，39(3):98 －100.

［4］ 劉宗昌，王德才.刺五加注射液的不良反應［J］.中國中醫藥信息雜志，2002，9(1):68 －69.

［5］ 于鳳平，胡昌勤，崔生輝.刺五加注射液中過敏性雜志的分析［J］.中國藥學雜志，2008，43(5):384 －387.

［6］ 范能全.刺五加注射液致敏物質檢測及處理方法［J］.重慶師范大學學報:自然科學版，2011，28(1):68 －70.