中藥黃連結腸定位包衣片在家兔體內的藥物動力學研究

王建明，王宇，薛紅梅，高珊珊

(1.黑龍江中醫藥大學中醫藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

中藥黃連結腸定位包衣片是以黃連提取物為原料藥，Eudragit(優特奇)水分散體為包衣材料，根據pH敏感－時間控釋雙重機理，利用多層包衣技術制備的新型中藥結腸靶向給藥系統［1－3］。其理想的體內代謝效果是在降低血藥濃度的同時，提高結腸局部藥物濃度，從而達到對結腸疾病產生較好的局部治療作用和提高生物利用度的效果［4］。本實驗主要是通過對比黃連結腸定位包衣片和黃連提取物未包衣片芯在生物體內的釋藥特征，從而對黃連結腸定位包衣片的結腸定位效率作出評價。

1 實驗材料

1.1 試藥

黃連結腸定位包衣片(自制，規格:280mg/片，代號為T);未包衣黃連載藥片芯(自制，規格:280mg/片，代號為R);鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號713－8702);磷酸二氫鉀為分析純(天津市津東天正精細化學試劑廠);乙腈為色譜純(Dikmapure公司);其它試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters2487型高效液相色譜儀;KDC－160HR高速冷凍離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司);XW－80A漩渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司);KQ－300VDE型雙頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);AG－135型電子分析天平(瑞士 METTLER－TOLEPO公司);微量取樣器(上海大龍醫療設備有限公司)。

1.3 受試動物

新西蘭健康大耳白兔6只，雌雄各半，體質量1.5～2.5kg，黑龍江中醫藥大學 GLP實驗動物中心提供。

1.4 藥代動力學分析軟件

WinNonlin 5.2版藥代動力學分析軟件。

2 實驗方法與結果

2.1 給藥及樣品采集

將6只家兔隨機等分成兩組，每組3只。受試制劑組(T)，參比制劑組(R)。兩種制劑的給藥劑量均為3片/只，按每日單劑量給藥。為確保實驗結果的準確性，灌胃時應防止家兔將包衣片嚼碎。

受試家兔給藥前禁食12h，自由飲水。給藥前先自耳緣靜脈采取空白血液，以作空白和回收試驗用。按照給藥方案設計的給藥方法，分別單次口服受試制劑3片或參比制劑3片。兩組家兔均在給藥后1，2，3，4，5，5.5，6，6.5，7，8，10，12，14，16，18，20，22，24h 于耳緣靜脈取血約2mL置于肝素鈉處理過的負壓玻璃管中，膠塞密封，3 000r/min離心15min，分離血漿，移取上清液于離心管中，標注試驗號及采血時間，血樣放置于冰箱冷凍室中－20℃保存，以備處理分析。

2.2 鹽酸小檗堿在生物樣品中的測定方法與評價

2.2.1 血漿樣品預處理方法的比較

血漿樣品進行藥代動力學研究前均需沉淀除去蛋白，本試驗分別對常用蛋白沉淀劑高氯酸、甲醇和乙腈的沉淀效果進行了考察。

精密吸取濃度為18μg/mL的鹽酸小檗堿對照品溶液50μL于離心管中，水浴40℃揮干溶劑，加入家兔空白血漿100μL，再加入500μL的甲醇，渦旋振蕩混合1min，以3 000r/min離心15min，取上清液，N2吹干，甲醇定容至0.5ml，經0.45μm的微孔濾膜過濾后，進樣20μL，重復2次，利用當日標準曲線計算藥物濃度。同法分別用高氯酸和乙腈處理血漿樣品。結果見表1。

表1 血漿樣品的預處理

實驗結果表明，用高氯酸和乙腈沉淀處理蛋白時，鹽酸小檗堿的檢測被雜質峰所干擾，樣品的峰形不好，回收率過低。而用甲醇沉淀處理蛋白時，樣品的峰形很好，回收率也符合藥物動力學的研究要求，因此用甲醇作為蛋白沉淀劑處理血漿樣品更適合本實驗。

2.2.2 血漿中藥物含量測定方法的建立

2.2.2.1 色譜條件

色譜柱:Diamonsil(TM)C18柱(4.6mm×200mm，5μm);流動相:乙腈 －磷酸二氫鉀(30∶70);檢測波長:265nm;流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;進樣量:20μL。

2.2.2.2 標準溶液的配制

精密稱取鹽酸小檗堿對照品18mg置于100ml的容量瓶中，甲醇定容至刻度，得到0.18mg/ml的對照品貯備液，精密移取鹽酸小檗堿對照品貯備液1mL，以甲醇定量稀釋配制成1.8μg/ml的鹽酸小檗堿對照品溶液，置于4℃冰箱中避光冷藏備用。

2.2.2.3 標準曲線的制備

精密吸取1.8μg/ml的鹽酸小檗堿對照品溶液40μL，160μL，320μL，400μL，800μL，置于離心管中，于40℃水浴揮干溶劑后，分別精密加入空白血漿1 000μL，渦旋振蕩混合1min后，按血漿樣品預處理方法進行處理。利用高效液相分析測定，進樣量為10μL。以血藥濃度為橫坐標(X)，色譜峰面積值為縱坐標(Y)進行線性回歸，得濃度與峰面積的標準曲線，回歸方程為:Y=20 624X+158.67，相關系數r2=0.999 8。

結果表明，鹽酸小檗堿在0.072～1.44μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.2.4 專屬性考察

將空白血漿、樣品血漿、對照品溶液和空白血漿加對照品均按血漿樣品預處理方法進行處理，在上述色譜條件下進樣各20μL測定，所得色譜圖見圖1。

圖1 血漿樣品的專屬性

由圖可見，在上述色譜條件下，鹽酸小檗堿的保留時間均為11min左右，且分離度良好，血漿內源物質不干擾鹽酸小檗堿的測定，因此本方法具有良好的專屬性。

2.2.2.5 靈敏度試驗

配 制 濃 度 為 0.007 2，0.072，0.288，0.432，1.44μg/ml血漿對照品溶液，按標準曲線制備方法處理進樣，重復3次，測得各質量濃度鹽酸小檗堿的峰面積與噪音峰面積，按色譜峰信噪比S/N≥3時鹽酸小檗堿的質量濃度為最低檢測質量濃度，結果得出鹽酸小檗堿最低檢測質量濃度為0.007 2μg/ml。

2.2.2.6 回收率試驗

方法回收率:取空白血漿100μL，加入鹽酸小檗堿對照品溶液，配制高、中、低三種不同濃度的鹽酸小檗堿血漿樣品(濃度分別為 72、36、7.2μg/mL)，按照血漿樣品的處理方法和測定方法操作，進樣分析，由當日標準曲線求出各樣品的濃度，并與加入濃度相比較，計算平均方法回收率。結果見表2。

絕對回收率:按照方法回收率實驗方法配制高、中、低3種濃度的鹽酸小檗堿血漿樣品(濃度分別為72、36、7.2μg/mL)，血漿樣品經預處理后，進樣分析，將結果與同等濃度的標準品直接進樣分析測得的峰面積相比較，計算平均絕對回收率。結果見表2。

2.2.2.7 精密度試驗

取空白血漿100μL，加入鹽酸小檗堿對照品溶液，配制成高、中、低三種不同濃度的鹽酸小檗堿血漿樣品(濃度分別為 72、36、7.2μg/mL)，按照血漿樣品的處理方法和測定方法，進樣分析同一樣品溶液平行操作5次，同一批樣品溶液連續測定5天，由當日標準曲線求出各樣品的濃度，求得日內及日間精密度。結果見表2。

表2 回收率與精密度測定結果 (n=5)

實驗結果表明，該研究方法在高、中、低三個濃度水平的方法平均回收率大于80%;絕對平均回收率大于90%;血漿樣品的日內、日間的精密度RSD皆小于5%，滿足生物樣品的測定要求，能夠用于受試制劑和參比制劑的體內藥物動力學研究。

2.2.2.8 穩定性試驗

血漿樣品按血漿樣品預處理方法和測定方法，在48h之內的不同時間點進樣分析，結果鹽酸小檗堿峰面積的RSD值為3.68%，表明血漿樣品至少在48h內穩定。

2.3 家兔體內藥動學研究

將6只家兔隨機分為兩組，分別采用黃連提取物結腸定位包衣片和未包衣片芯口服給藥后，在不同時間點采血，按血漿樣品預處理的方法和樣品測定方法，通過反相高效液相色譜RP－HPLC方法測定鹽酸小檗堿的血藥濃度。得到平均血藥濃度－時間曲線見圖2及圖3;所得數據用藥動學軟件WinNonlin 5.2進行數據擬合，結果表明，黃連結腸定位包衣片和未包衣片口服后在家兔體內的藥代動力學參數均符合一室模型，主要動力學參數見表3。

圖2 家兔口服黃連未包衣片后的血藥濃度－時間曲線

圖3 家兔口服黃連包衣片后的血藥濃度時間曲線

表3 參比制劑與受試制劑主要藥動學參數的比較

3 討論

鹽酸小檗堿為中國藥典收載的常用抗菌藥，在治療腸炎方面療效顯著，副作用小。但如果作為治療結腸疾病的藥物，到達病灶處的藥量過低嚴重影響了鹽酸小檗堿的生物利用率［5］。而黃連的結腸定向包衣片擁有直接作用結腸，避免胃酸、酶類破壞，降低血藥濃度，延長作用時間，減少毒副作用等特點［6－8］。因此為解決其生物利用度低的問題提供一個良好的方案。

本試驗血漿樣品成分比較復雜，干擾物多，待測藥在血漿中的含量很低，不經預處理往往不易被儀器檢出。因此對不同方法處理的樣品進行了對比，結果表明，本試驗中采用甲醇作為蛋白沉淀劑比高氯酸和乙腈的沉淀效果更好。

本研究顯示，黃連結腸定位包衣片與未包衣片在家兔體內藥物動力學行為差異顯著，未包衣片芯口服后0.5h即可檢測到藥物，Tmax為3h，而結腸定位包衣片在口服5h后才可檢測出藥物，Tmax為8h，這與體外時滯相比略有延遲。表明受試制劑在胃內和小腸部的釋放量少，降低了胃部胃酸的降解和小腸吸收的肝首過效應，提高了生物利用率。結腸定位包衣片的AUC值僅為普通片的30.1%，其Cmax值僅為普通片的22.1%，這說明吸收進入血液循環的藥量顯著降低，從而使大部分藥物停留在結腸局部，有利于結腸局部病變部位的治療。

本實驗表明，黃連結腸定向包衣片可以將藥物輸送到結腸部位達到結腸定位靶向效果，且效果明顯，可以顯著提高了藥物的生物利用率。

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