齊墩果酸對肉瘤S－180荷瘤小鼠細胞凋亡相關基因表達的影響

吳勃巖，孫陽，梁穎，吳勃力，畢克濱，趙文靜，裴麗，王艷杰

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

細胞凋亡與腫瘤發生發展的研究已經成為生命科學中的研究熱點，誘導腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤的重要途徑。齊墩果酸(Olesnolic Acid，簡稱OA)，為三萜類脂溶性活性物質，是一種天然產物化學成分，廣泛存在于女貞子、白花蛇舌草、夏枯草、大棗、牛膝、西洋參、連翹、山芝麻、甘草等植物中。齊墩果酸具有多種藥理作用，具有保肝降酶、抗炎、抗病毒、免疫雙向調解作用、抑瘤、抗衰老等作用［1］。本文研究齊墩果酸對肉瘤S－180荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡相關基因p53基因、Bcl－2基因表達的影響，探討抗腫瘤作用機制，為齊墩果酸用于腫瘤治療提供新的思路和實驗數據。

1 材料

1.1 實驗動物

昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±2)g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物、瘤株和試劑

齊墩果酸(珠海潤都制藥有限公司);小鼠S－180腹水瘤株(哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院);PV二步法檢測試劑盒及p53、Bcl－2單抗(北京中杉金橋生物技術有限公司);環磷酰胺(CTX，上海華聯制藥有限公司)。

2 實驗方法

2.1 昆明種小鼠S－180肉瘤腫瘤模型的建立

抽取小鼠S－180腹水用生理鹽水1∶2稀釋，取昆明種小鼠30只，以0.1ml/只接種右側腋下制備局灶性實體瘤模型。

2.2 凋亡調控基因p53、Bcl－2表達的檢測

取接種S－180腫瘤細胞的小鼠隨機分為3組:模型組，CTX組，OA組。于接種S－180腫瘤細胞6h后首次給藥，OA組每天按2.496mg/kg體重灌服給藥1次，CTX組按40mg/kg體重腹腔注射1次，模型組每天用生理鹽水0.2ml/只灌服1次，連續給藥8天。處死小鼠剝離腫瘤組織，采用PV二步法免疫組化法常規制片，檢測凋亡調控基因p53、Bcl－2表達的情況。利用Motic Images Advanced 3.2分析軟件對各組腫瘤組織中凋亡調控基因表達產物突變型p53蛋白陽性細胞平均光密度值和Bcl－2蛋白陽性細胞平均光密度值進行分析。

2.3 統計學方法

表1 齊墩果酸對S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白表達的影響(±s)

表1 齊墩果酸對S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白表達的影響(±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05。

組別給藥量(mg/kg)n 平均光密度值(±s)p53蛋白 Bcl－2蛋白模型組 － 10 0.261 4 ±0.016 7 0.248 8 ±0.009 5 CTX 組 40 10 0.214 0 ±0.010 6* 0.203 4 ±0.005 6*OA 組 2.496 10 0.241 2 ±0.018 5* 0.232 2 ±0.011 6*

3 結果

齊墩果酸對S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡調控基因p53、Bcl－2表達的影響，經免疫組化方法染色后，觀察p53蛋白和Bcl－2蛋白表達在細胞核呈現棕黃色或棕褐色顆粒狀染色為陽性細胞，細胞核藍染的細胞為蘇木素復染的陰性細胞。在10×40高倍鏡下，每張標本隨機選取5個視野，精確選取視野內所有的陽性顆粒，對S－180荷瘤小鼠腫瘤組織中各組突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白陽性細胞平均光密度值進行分析。結果見表1，與模型組比較，齊墩果酸組突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白平均光密度值均明顯降低(P＜0.05)，差異顯著，具有統計學意義。

4 討論

誘導腫瘤細胞凋亡是抗腫瘤的分子機制之一，許多人類惡性腫瘤的發展是其細胞的死亡過程嚴重受阻，而使腫瘤細胞在數量上無限制惡性增殖的結果。p53基因是與人類腫瘤相關性最高的抑癌基因，p53基因抗腫瘤的機制之一就是觸發腫瘤細胞凋亡。p53基因分野生型和突變型兩種類型。野生型p53基因通過下調Bcl－2蛋白，上調Bax蛋白而誘導細胞凋亡;p53基因與其它調節細胞凋亡的基因或因子也相互作用和相互影響。而突變型p53基因則對細胞凋亡有抑制作用，p53基因突變后變為癌基因，并且表達增強，突變型p53蛋白半衰期延長，在組織和細胞中能檢測到升高，故一般認為免疫組化檢測到的是突變的p53基因表達產物，突變型p53基因具有致癌作用，其表達產物在人類大多數腫瘤中都過量表達。突變型p53蛋白表達增高與DNA修復能力的下降呈正相關性。Bcl－2基因是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，可抑制細胞凋亡。Bcl－2通過阻斷程序性細胞死亡信號傳遞系統的最后的共同通道而抑制細胞凋亡，從而促進細胞的存活，因而它是一種重要的細胞生存基因。Bcl－2蛋白和突變型p53蛋白的過度表達可引起腫瘤等許多疾病，使之成為治療這些疾病的藥物作用的重要靶位。在惡性腫瘤細胞中，突變型p53蛋白和Bcl－2蛋白過度表達［2－5］。實驗結果提示，齊墩果酸能下調S－180荷瘤小鼠腫瘤細胞內Bcl－2蛋白和突變型p53蛋白的表達，從而實現誘導腫瘤細胞凋亡達到抗腫瘤的作用，其機制還有待于進一步的研究。

［1］ 王奇，蘆柏震.齊墩果酸的研究進展［J］.中國藥房，2008，19(9):711－712.

［2］ 宋旭紅.阿魏蘑菇提取物對腫瘤細胞p53表達的影響［J］.中國公共衛生，2003，19(6):690 －691.

［3］ 應小平，史迎麗，郭蘭生，等.山仙顆粒對小鼠S－180肉瘤的抑瘤作用及bcl－2基因表達影響的實驗研究［J］.陜西中醫，2006，27(12):1588－1590.

［4］ 周忠光，白云，趙鑫，等.蝙蝠葛酚性堿對BxPC－3荷瘤裸鼠細胞凋亡相關基因P53蛋白表達的影響［J］.中醫藥學報，2011，39(2):31－33.

［5］ 尹麗穎，邊曉燕，肖洪彬，等.遼東楤木葉總皂苷對H22荷瘤小鼠p53及PCNA蛋白表達的影響［J］.中醫藥學報，2010，38(1):18－20.