阿霉素－槲皮素復方脂質體的制備

陳浩，王玉蓉，孫毅坤，周洪偉，黃秀榮，戴俊東

(北京中醫藥大學，北京 100102)

多藥耐藥(MDR)［1］仍然是腫瘤治療的主要挑戰，固有和獲得的MDR可在多種腫瘤中發生，尤其是廣譜抗癌藥的代表阿霉素(Doxorubicin，DOX)，MDR是導致其癌癥治療失效的主要原因。目前較常用的抗耐藥方法是使用耐藥逆轉劑，近來研究表明，槲皮素(Quercetin，QUE)不但能抑制多種腫瘤細胞的增殖，還能調節CYP3A4及P－糖蛋白表達逆轉MDR的活性［1－4］，但 QUE 水 溶 性 差，在 水 中 溶 解 度 僅 為0.047mg/mL［5］，要發揮療效往往需要應用一定的制劑技術來增溶以提高其生物利用度。脂質體作為抗腫瘤藥物的優良載體，既能提高QUE的溶解度，又能靶向腫瘤細胞以降低DOX的心臟毒性［6］，故制備DOXQUE復方脂質體(DQ－Lip)，兩藥合用的同時利用脂質體的滲透滯留增強效應(EPR)［7］靶向于腫瘤部位，降低腫瘤細胞的MDR，提高療效。

1 材料與儀器

槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100081－200406，純度:97.3%);槲皮素(四川協力有限公司，批號090503);鹽酸阿霉素(北京華豐科技有限公司，批號HF090516);氫化大豆磷脂SPC－3(Lipoid);膽固醇(Sigma);除高效液相分析所用試劑為色譜純外;其它試劑均為分析純;核跡聚碳酸酯微孔濾膜(英國Waters公司)。

RE－52CS型旋轉蒸發儀(上海亞榮);SCIENTZ－IID型超聲波細胞粉碎儀(浙江新芝);NANO－CS型動態光散射粒徑儀(美國馬爾文);JEM－1230型透射電鏡(日本JEOL);TU－1810APC型紫外可見分光光度計(北京普析通用);SPD－20A型高效液相色譜儀(日本島津);DL－5－B型離心機(上海安亭);XL－90型超速離心機(美國BeckMan)。

2 方法與結果

2.1 脂質體的制備 采用硫酸銨梯度法［8］制備DQ－Lip:取處方量氫化大豆磷脂、膽固醇、槲皮素(HSPC∶CH=3∶1mol/mol、HSPC∶QUE=20∶1mol/mol)，溶于9mL無水乙醇中，置于250mL梨形瓶內，40℃水浴減壓旋轉蒸發除去無水乙醇，形成均勻透明薄膜，加入0.15mol/L硫酸銨溶液10mL，75℃水浴常壓旋轉水化30min，使磷脂充分溶脹水合。所得淡黃色混懸液經探頭超聲(600W)9min，再依次經0.8μm、0.4μm核跡聚碳酸酯膜擠出各5次整粒，即得淡黃色的槲皮素脂質體(QUE－Lip)［9］。放置過夜后置于透析袋(分子量8 000～14 000M)中，放入300mL生理鹽水，冰水浴下560rpm磁力攪拌10h，每40min更換1次生理鹽水，充分形成硫酸銨梯度;再與2mg/mL的DOX 溶液 1∶1(v/v)混合(DOX:HSPC=1∶7.9w/w)，55℃水浴孵育25min，取出后冰水浴冷卻，即得DQLip。

2.2 脂質體包封率測定 采用超速離心法測定脂質體中DOX與QUE的包封率。精密量取DQ－Lip溶液0.1mL，置于5mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻;取適量至離心管內，以200 000g保持4℃恒溫超速離心2h，精密量取上清液1mL，置于5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.45μm濾膜過濾后進樣15μl，HPLC法測定其中 DOX、QUE 的含量 W1。另精密量取DQ－Lip溶液0.1mL，直接用甲醇溶解并稀釋至25mL，依法測定其中DOX、QUE的總含量W2。

RP－HPLC色譜條件:色譜柱:Kromasil C－18柱(4.6 ×250mm，5μm);流動相:甲醇:乙腈:PBS(pH 3.8)=19∶29∶52;流速:1.0mL/min;柱溫:25℃;檢測波長:254nm。

2.3 脂質體粒度分布測定 采用馬爾文動態光散射粒徑儀檢測平均粒徑(A－Size)和多分散系數(PDI)。激光束波長633nm，入射與散射光束夾角173°，溫度25℃。取100μL脂質體溶液用水稀釋至1.5mL，搖勻平衡3min后測定。

2.4 脂質體形態學考察 采用負染透射電鏡觀察。將樣品稀釋至適當濃度后，滴于300目銅網表面，5min后用濾紙吸去多余液體，加入1滴2%磷鎢酸溶液(pH 7.0)染色5min，濾紙吸去多余液體，自然晾干后測定。

2.5 脂質體制備工藝研究

2.5.1 孵育包封DOX對脂質體粒徑及QUE包封率的影響 取QUE－Lip，65℃水浴孵育包封DOX制備DQ－Lip。取包封DOX前后的樣品照2.3項下方法測定粒度分布，結果如圖1所示:平均粒徑從174.8nm降低至 151.8nm，PDI從 0.622 降低至 0.383，表明加熱孵育DOX對脂質體的粒度無負影響。取包封DOX前后的樣品照2.2.4項下方法操作，測定QUE的包封率。結果表明，包封DOX后QUE的包封率從94.7%下降至80.7%，說明孵育加熱會造成已包封于磷脂雙分子層內的部分QUE泄漏，從而降低QUE的包封率。

2.5.2 孵育溫度對DOX包封率的影響 將形成硫酸銨梯度的QUE－Lip與2mg/mL阿霉素溶液1:1 v/v混合(DOX∶HSPC=2∶7.9w/w)，分別于 45℃、55℃、65℃水浴條件下孵育25min，取出后冰水浴冷卻，考察孵育溫度對脂質體包封率的影響，實驗結果見表1。結果表明，在55℃水浴條件下孵育DOX的包封率最高。

表1 包封溫度對DOX包封率的影響 (n=3)

2.5.3 藥脂比與硫酸銨濃度對DOX包封率的影響

分別采用不同藥脂比的QUE(QUE∶HSPC=1∶15、1∶20mol/mol)和硫酸銨梯度(濃度為 0.15mol/L、0.25mol/L)制備QUE－Lip;然后于55℃水浴孵育包封不同藥脂比的 DOX(DOX:HSPC=1∶7.9、2∶7.9w/w)制備DQ－Lip，考察各因素對DOX包封率的影響。結果表明(表2)，隨脂質體中QUE和DOX藥脂比的增加，DOX的包封率下降;而增大硫酸銨梯度有助于提高DOX的包封率。

圖1 包封DOX對脂質體粒徑的影響

表2 藥脂比與硫酸銨梯度對DOX包封率的影響 (n=3)

2.5.4 DQ－Lip制備工藝驗證 選擇QUE藥脂比為1:20mol/mol、水化硫酸銨濃度為0.15mol/L，55℃水浴孵育包封DOX(藥脂比1:7.9w/w)，重復制備3批DQ－Lip。經檢測，DOX與QUE的包封率分別為(90.6±0.61)% 和(83.3 ± 0.24)%，RSD 分別為 0.29% 和0.68%(n=3);DQ－Lip的平均粒徑為138.5nm，PDI為 0.264，分布均勻，粒度圓整(圖2、圖3)。

3 討論

硫酸銨梯度法制備脂質體中，脫鹽形成硫酸銨梯度的方法主要為葡聚糖凝膠柱層析法(包含微柱離心法)和透析法。對于凝膠柱層析法而言，實驗發現，QUE會與葡聚糖凝膠G－50強烈吸附，采用水、生理鹽水、PBS緩沖液等方法均難以洗脫;同時柱層析法在一定程度上會造成脂質體的稀釋，不利于DQ－Lip的制備。透析法雖然耗時較長，但操作簡便，能在不稀釋脂質體的前提下充分脫鹽，在脂質體膜內外形成足夠的硫酸銨梯度，從而保證DOX的高包封，因而本文采用透析法制備DQ－Lip。

圖2 DQ－Lip粒度分布結果

脂質體中藥物包封率是其質量評價的重要指標，測定方法需根據實驗的具體情況進行選擇。其常用的測定方法包括透析法、葡聚糖凝膠柱層析法、魚精蛋白沉淀法和高速離心法。其中，透析法所需樣品量大，持續時間長，主要用于水溶性藥物的測定，對QUE等疏水性藥物不適用;QUE會與G－50強烈吸附，故凝膠柱層析法也不適于本實驗;魚精蛋白沉淀法主要用于負電荷脂質體和中性脂質體中藥物包封率的測定［10］，實驗結果表明，DOX電離后形成的陽離子會吸附于DQ－Lip表面，降低帶正電荷的魚精蛋白對脂質體的絮凝作用，使脂質體沉淀不完全，以致藥物包封率測定結果偏低。綜上，本實驗最終確定以經典的高速離心法測定DQ－Lip中DOX與QUE的包封率，結果表明此法可行，所得結果準確。

圖3 DQ－Lip透射電鏡照片

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