蜂膠抑制白血病K562細胞增殖機制的初步研究*

汪 茗， 章 堯， 戚之琳， 畢富勇

(皖南醫學院生化教研室，安徽蕪湖241002)

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物幼芽及樹木枝條上采集樹脂類物質，與其唾液混合加工而成的一種芳香性膠狀固體物，含有黃酮、萜烯、肉桂酸衍生物等300多種成分。蜂膠作為民間藥物，對于炎癥、腫瘤[1]、心臟病[2，3]等均具有治療或預防作用。核孔復合物貫穿于核膜，是胞核與胞質物質交換的唯一通道，在細胞正常生長、分化過程中發揮著重要作用。其中核孔蛋白98(nucleoporin 98，Nup98)是與白血病發病關系最密切的核孔蛋白。本研究通過觀察蜂膠對K562細胞Nup98表達的影響來探討蜂膠抗白血病作用的分子機制。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株 人慢性粒細胞白血病K562細胞購自中科院上海細胞生物研究所。

1.2 試劑 蜂膠標準品購自Anksteh，用組織培養級的DMSO配成1×105mg/L的貯存液，用時稀釋，使DMSO終濃度≤0.1%。PCR引物由上海生工合成。Annexin V－FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物。鼠抗人Nup98單克隆抗體、HRP標記羊抗鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 分組 分對照組和蜂膠0.2、2、20、200 mg/L組。每組設3個復孔，重復3次，取均值。

2.2 細胞培養 采用含10%胎牛血清的培養液，于37℃、5%CO2、飽和濕度環境下培養。將不同濃度的蜂膠摻入細胞，孵育一定時間后收集細胞進行后續實驗。

2.3 MTT檢測 取對數生長期細胞，調整濃度為1×108/L，接種于96孔板。蜂膠作用24、48、72 h后取出培養板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37℃繼續培養4 h后，離心棄上清，加DMSO 150 μL，振蕩后酶標儀570 nm下測定各孔的吸光度(absorbance，A)值，按下式計算抑制率。抑制率(%)=(A對照－A實驗)/A對照×100%。

2.4 流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測 蜂膠作用24 h后收集細胞，Annexin V/PI雙染，按說明書處理，1 h內上機檢測細胞凋亡率。

2.5 RT－PCR檢測 蜂膠作用24 h后，Trizol提取總RNA，紫外分光光度計測RNA純度(A260/A280＞1.8)。兩步法按試劑盒說明進行擴增。Nup98上游引物 5＇－CTAGCAAC AATACTGGAGGC －3＇，下游引物 5＇－ CCTGAATTAGTGGTGGAGGA －3＇，產物612 bp。β－actin 為內參照，上游引物 5＇－TGAGACCTTCAACACCCCAG－ 3＇，下游引物 5＇－ GCCATCTCTTGCTCGAAGTC －3＇，產物 312 bp[4]。擴增條件:95℃預變性 3 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環;72℃ 10 min，4℃維持。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，EB染色，捷達801凝膠成像分析系統進行分析。ANup98/Aβ－actin表示Nup98 mRNA表達量的相對水平。

2.6 Western blotting 檢測 收集總蛋白，按 100 μg/well上樣。10%SDS－PAGE電泳后轉膜至NC膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，封Ⅰ抗 Nup98(1∶1 000)4℃過夜。第2 d TBST、TBS洗膜。封HRP標記的羊抗鼠Ⅱ抗(1∶5 000)45 min，同法洗膜。ECL化學發光，將膜置于暗盒中，暗室內膠片曝光，沖洗膠片。Gel－Pro Analyzer定量分析軟件分析結果。ANup98/AGAPDH表示Nup98蛋白表達量的相對水平。

3 統計學處理

結 果

1 蜂膠對K562細胞增殖的影響

蜂膠作用 24、48、72 h 后，2 mg/L、20 mg/L 和 200 mg/L蜂膠組K562細胞的增殖抑制率均高于對照組(P＜0.01)，且具有時間和劑量依賴性。其中200 mg/L組72 h的增殖抑制率可達88.76% ±1.42%，見圖1。

Figure 1.Effect of propolis on proliferation of K562 cells.±s.n=3.＊＊P ＜0.01 vs A.圖1 蜂膠對K562細胞增殖的影響

2 蜂膠對K562細胞凋亡的影響

蜂膠作用24 h后，2 mg/L、20 mg/L和200 mg/L組誘導K562細胞的凋亡率明顯高于對照組(P＜0.05)，具有劑量依賴性，見圖2。圖中右上象限為晚期凋亡細胞或壞死細胞，左下象限為陰性正常細胞，右下象限為早期凋亡細胞，左上象限為機械性損傷細胞。早期凋亡百分數與晚期凋亡百分數總和為總凋亡率。200 mg/L組的細胞總凋亡率可達25.01% ±2.51%。

Figure 2.Effect of propolis on apoptosis of K562 cells.±s.n=3.A:control;B:2 mg/L propolis;C:20 mg/L propolis;D:200 mg/L propolis.＊＊P ＜0.01 vs A.圖2 蜂膠對K562細胞凋亡的影響

3 RT－PCR檢測nup98mRNA表達

由圖3可見，β－actin在各組中的表達水平相似。在612 bp處可見200 mg/L組nup98 mRNA水平明顯下調。200 mg/L組nup98 mRNA的相對表達量與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，見表1。

4 Western blotting檢測Nup98蛋白表達

由圖4可見，各組內參照GAPDH的表達量未發生明顯變化，而Nup98蛋白表達量卻逐漸低于對照組，以200 mg/L組最為明顯。200 mg/L組Nup98蛋白的相對表達量與對照組相比有顯著差異(P＜0.01)，見表1。

討 論

Figure 3.Effect of propolis on the expression of nup98 mRNA in K562 cells.Lane 1:marker;Lane 2:control;Lane 3:2 mg/L propolis;Lane 4:20 mg/L propolis;Lane 5:200 mg/L propolis.圖3 蜂膠對K562細胞nup98 mRNA表達的影響

表1 蜂膠對K562細胞Nup98 mRNA及蛋白表達的影響Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

表1 蜂膠對K562細胞Nup98 mRNA及蛋白表達的影響Table 1.Effect of propolis on Nup98 mRNA and protein expression in K562 cells(±s.n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group mRNA Protein Control 0.328 ±0.050 1.256 ±0.010 2 mg/L propolis 0.319 ±0.060 1.229 ±0.030 20 mg/L propolis 0.323 ±0.060 1.157 ±0.050*200 mg/L propolis 0.118 ±0.060＊＊ 0.895 ±0.040＊＊

Figure 4.Effect of propolis on the expression of Nup98 protein in K562 cells.Lane 1:control;Lane 2:2 mg/L propolis;Lane 3:20 mg/L propolis;Lane 4:200 mg/L propolis.圖4 蜂膠對K562細胞Nup98蛋白表達的影響

已有研究表明，蜂膠可抑制大腸癌[5]、肺癌[6]等多種腫瘤細胞的增殖。本實驗結果也證明了在一定的范圍內，蜂膠也具有抑制白血病細胞增殖、誘導凋亡的作用，并呈時間、劑量依賴關系，這與之前的報道吻合。

雖然蜂膠的抗腫瘤效應已被證實，但其作用機制卻未得到系統闡明。Ishihara等[5]的研究提示，蜂膠的咖啡酸苯乙酯通過降低cyclin D1和c－Myc的表達，導致大腸癌細胞G1期阻滯和凋亡。巴西蜂膠中的阿替比林C通過促進p21CIP1mRNA表達，阻滯細胞在 G0/G1期，抑制其增殖。Cogulu等[7]報道馬尼薩蜂膠可通過抑制端粒酶逆轉錄酶的活性抑制白血病細胞的增殖。也有研究表明蜂膠通過線粒體凋亡途徑誘導腫瘤細胞凋亡[8]。

Nup98基因位于11p15.5，編碼98 kD的核孔蛋白，位于細胞核的膜內側及細胞核內。主要參與調節核內外蛋白質和RNA等物質的轉運[9]。其N末端FG重復序列的異常與白血病發病關系密切，在許多急性白血病、慢性粒細胞白血病急變期患者可檢測到與nup98有關的染色體易位、融合基因及轉錄產物。目前認為nup98－HOX融合基因的形成是白血病發病的重要原因。Kasper等[10]發現 Nup98 N末端FG重復序列與CBP/P300結合起轉錄激活作用。也有人推測融合蛋白通過引起核質轉運的缺陷而導致白血病的發生。還有研究提示Nup 98協同蛋白RAE－1(retinoic acid early inducible－1，視黃酸可誘導蛋白1)功能紊亂在白血病發生中可能發揮一定作用。

為探討蜂膠抑制白血病增殖的作用機制，本研究檢測了不同濃度蜂膠作用K562細胞后Nup98表達的情況。結果提示，在抑制K562細胞增殖的過程中，Nup98的表達在mRNA和蛋白水平均有下調，提示Nup98表達下調參與了蜂膠抑制K562細胞增殖的過程。但Nup98下調后通過何種信號途徑引起增殖抑制，需要我們下一步進行探索。

[1]Mishima S，Narita Y，Chikamatsu S，et al.Effects of propolis on cell growth and gene expression in HL－60 cells[J].J Ethnopharmacol，2005，99(1):5 －11.

[2]張云香，王家富，李 偉，等.蜂膠水提液對體外培養的血管內皮細胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志，2008，24(1):60 －63.

[3]張云香，陳文峰，王家富，等.蜂膠水提物對血管內皮細胞黏附分子表達的影響[J].中國病理生理雜志，2010，26(12):2311 －2315.

[4]吳秋玲，陳 燕，陳衛華，等.魚藤素對K562細胞nup98表達的影響[J].中國實驗血液學雜志，2007，15(1):25 －28.

[5]Ishihara M，Naoi K，Hashita M，et al.Growth inhibitory activity of ethanol extracts of Chinese and Brazilian propolis in four human colon carcinoma cell lines[J].Oncol Rep，2009，22(2):349 －354.

[6]Li F，Awale S，Tezuka Y，et al.Cytotoxicity of constituents from Mexican propolis against a panel of six different cell lines[J].Nat Prod Commun，2010，5(10):1601 －1606.

[7]Cogulu O，Biray C，Gunduz C，et al.Effects of Manisa propolis on telomerase activity in leukemia cells obtained from the bone marrow of leukemia patients[J].Int J Food Sci Nutr，2009，60(7):601 －605.

[8]Eom HS，Lee EJ，Yoon BS，et al.Propolis inhibits the proliferation of human leukaemia HL－60 cells by inducing apoptosis through the mitochondrial pathway[J].Nat Prod Res，2010，24(4):375 －386.

[9]謝志堯，陳 竺.NUP98－HOXA9融合基因與白血病[J].國外醫學:輸血及血液學分冊，2005，28(3):201 －203.

[10]Kasper LH，Brindle PK，Schnabel CA，et al.CREB binding protein interacts with nucleoporin－specific FG repeats that activate transcription and mediate NUP98－HOXA9 oncogenicity[J].Mol Cell Biol，1999，19(1):764 －776.