葡萄糖調節蛋白78 在復合致病因素誘導的大鼠肝肺綜合征中的作用*

賈建桃， 張慧英△， 田小霞， 冀菁荃， 張麗麗， 呂敏麗，王黎敏， 封 明， 趙中夫， 韓德五， CHENG Ji

(1 長治醫學院病理生理學教研室，3 長治醫學院機能綜合實驗室，4 長治市人民醫院神經外科，5長治醫學院肝病研究所，山西 長治046000;2 山西醫科大學附屬第一人民醫院神經內科，6山西醫科大學肝病研究所，山西 太原030001;7 美國南加州大學KECK 醫學院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉機90089)

肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是指在急慢性肝病、特別是肝硬化基礎上發生的呼吸功能障礙，其病理特征為彌漫性肺血管病變以及由此導致的低氧血癥。腸源性內毒素血癥(intestinal endotoxemia，IETM)在HPS 的發病中發揮重要作用［1］。內毒素是誘導內質網應激(endoplasmic reticulum stress)、導致其標志分子葡萄糖調節蛋白78(78 kD glucose- regulated protein，GRP78)表達增高的重要因素［2］。研究發現，內質網應激在酒精性和非酒精性肝損傷以及由CCl4誘導的動物肝硬化發病中發揮重要作用，GRP78 的表達也明顯增高［3，4］。由此，我們推測GRP78 很可能也參與了HPS 的發病過程，而且可能與腸源性內毒素血癥之間存在密切聯系。本研究通過檢測復合致病因素誘導的肝硬化合并HPS 大鼠不同時點肺組織中GRP78 的表達，并且觀察其與血漿內毒素變化之間的相關關系，旨在探討GRP78 在HPS 發病中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 Wistar 清潔級大鼠，由山西醫科大學動物實驗中心供應。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠GRP78 多克隆抗體購自Sigma;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術有限公司;鼠抗兔3 -磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase單克隆抗體，GAPDH)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG 均購自碧云天生物技術研究所;SuperECL Plus 超敏發光液和BCA 法蛋白定量試劑盒購自普利萊基因技術有限公司;Trizol 試劑盒和RT- PCR 試劑盒購自Gibco;TaqDNA 聚合酶購自Promega;GRP78 和GAPDH 引物由中山大學達安基因診斷中心合成;內毒素顯色基質鱟試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司;丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒和考馬斯亮藍法蛋白定量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF -α)放射免疫分析藥盒購自北京華英生物技術研究所。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立 雄性Wistar 大鼠，體重200 -240 g，隨機分為4 周、6 周和8 周3 個組，每個組隨機分為正常對照組和模型組。對照組動物給予標準飼料和自來水，模型組動物用復合致病因素法復制肝硬化合并HPS 模型［5，6］:以摻入膽固醇(占飼料總重量的0.5%)的玉米面作飼料(前2 周摻入豬油20%);以5% -15%(體積比)乙醇作為唯一飲用水，首次皮下注射CCl4原液(5 mL/kg BW)，以后改為每隔3 d 皮下注射40% CCl4油溶液(大豆油稀釋，劑量3 mL/kg BW)。分別于各時點，全麻、無菌、無內毒素條件下經腹主動脈采集血液，3 000 r/min離心15 min，吸取血漿，-70 ℃保存備用;取部分肝臟右葉組織和左側肺臟組織立即置于液氮中保存備用，其余組織10%中性甲醛固定，用于組織學研究。

2.2 生化檢測 (1)血漿標本:采用賴氏法測定ALT 活性、鱟實驗法測定內毒素水平、放免法檢測TNF-α 水平，均依照試劑盒說明進行操作。(2)肺組織標本:肺組織經超聲勻漿后，考馬斯亮藍法進行蛋白定量，遵照試劑盒說明書采用硫代巴比妥酸法測定MDA 含量，放免法測定TNF-α 含量。

2.3 肝和肺組織HE 染色 以石蠟包埋的肝和肺組織標本制備4 μm 切片，HE 染色，光學顯微鏡下觀察病理學改變。

2.4 Western blotting 法檢測肺組織中GRP78 蛋白的表達 取肺組織超聲裂解后，BCA 法蛋白定量。取50 μg 蛋白，變性，上樣，經10%SDS -PAGE 凝膠電泳后，電轉移至硝酸纖維素膜，封閉后加入兔抗大鼠GRP78 多克隆抗體(1∶1 000 稀釋)4 ℃過夜，洗滌后加入辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶1 000 稀釋)室溫1 h，洗滌后加ECL 超敏發光液，X 線膠片曝光、顯影。以GAPDH 為內參照。采用分子生物學圖像分析系統進行定量掃描測定條帶灰度值，將每個樣本的灰度值與相應GAPDH 的灰度值相比，計算蛋白的表達水平。

2.5 RT-PCR 法檢測肺組織中GRP78 mRNA 的表達 取肺組織100 mg，提取總RNA，紫外分光光度計檢測波長為260 nm 和280 nm 的吸光度(A)，兩者的比值代表RNA 純度及濃度。取50 μg 總RNA 按照說明書進行逆轉錄和擴增。GRP78 引物序列:上游引物5' -GGA GGA TGT GGG CAC GGT GGT C-3'，下游引物5' - GTC ATT CCA AGT GCG TCC GAT GAG G -3'，擴增片段長度385 bp;GAPDH 為內參照，其引物序列，上游引物5' -GGT CAT CAA CGG GAA ACC C-3'，下游引物5' -TCT GAG TGG CAG TGA TGG CA -3'，擴增片段長度450 bp。擴增參數:95 ℃預變性2 min，95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，進行30 個循環，最后72 ℃5 min。DNA 標準(D12000)確定PCR 產物大小，經2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析儀上進行吸光度掃描并采用Quantity One 凝膠分析系統(Bio -Rad)測定目的條帶與GAPDH 條帶的吸光度，以兩者的比值表示目的mRNA 的相對含量。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0 軟件分析，計量資料數據以均數±標準差(±s)表示，單因素方差分析法比較多個樣本均數，采用LSD-t 檢驗法進行均數之間的兩兩比較，線性相關法分析兩兩指標間的相關性。

結 果

1 血漿和肺組織中各項生化指標的變化

模型組血漿內毒素水平隨HPS 的病程進展逐漸增高，各時點間有顯著差異(P ＜0.05);模型組血漿和肺組織勻漿TNF-α 含量和血漿MDA 含量也隨病程進展而逐漸增高，各時點間有顯著差異(P ＜0.05)。模型組各項指標分別在第6 周和第8 周與相應正常對照組相比有顯著差異(P ＜0.05)，見表1、2。

表1 各時點對照組和模型組HPS 大鼠血漿內毒素、TNF－α 和ALT 水平的變化Table 1. Plasma levels of endotoxin，TNF-α and ALT in normal control(NC)and HPS (M)groups(±s)

表1 各時點對照組和模型組HPS 大鼠血漿內毒素、TNF－α 和ALT 水平的變化Table 1. Plasma levels of endotoxin，TNF-α and ALT in normal control(NC)and HPS (M)groups(±s)

* P ＜0.05 vs NC;△P ＜0.05 vs the 4th week;#P ＜0.05 vs the 6th week.

Endotoxin (103EU/L)TNF-α(μg/L)ALT (IU/L)NC(n=6) M(n=11) NC(n=6) M(n=11) NC(n=6) M(n=11)The 4th week 0.039±0.014 0.068±0.035 0.955±0.123 1.526±0.162*209.250±5.234 220.920±1.697 The 6th week 0.040±0.021 0.273±0.169＊△ 1.025±0.245 1.728±0.416* 207.050±1.835 311.040±2.758＊The 8th week 0.042±0.032 0.642±0.427＊△# 1.221±0.286 1.864±0.318＊△ 199.900±2.459 253.660±3.765＊△△#

表2 各時點對照組和模型組HPS 大鼠肺組織勻漿TNF－α和MDA 含量變化Table 2. Contents of TNF-α and MDA of lung tissue in normal control(NC)and HPS (M)groups(±s)

表2 各時點對照組和模型組HPS 大鼠肺組織勻漿TNF－α和MDA 含量變化Table 2. Contents of TNF-α and MDA of lung tissue in normal control(NC)and HPS (M)groups(±s)

* P ＜0.05 vs NC;△P ＜0.05 vs the 4th week;#P ＜0.05 vs the 6th week.

TNF-α(μg/L)MDA(μmol/g)NC(n=6) M(n=11) NC(n=6) M(n=11)The 4th week 0.849±0.071 1.219±0.051*1.651±1.432 2.463±0.574 The 6th week 0.941±0.183 1.987±0.772＊△1.819±1.157 3.214±1.991＊△The 8th week 0.982±0.108 2.018±0.325＊△1.686±1.112 5.167±0.455＊△#

2 肝和肺組織病理變化

肝組織HE 染色顯示，正常組肝小葉結構規整，肝細胞索排列整齊，呈放射狀圍繞在中央靜脈周圍，肝細胞質豐富，核圓形，藍染，見圖1A;模型4 周組:肝細胞索排列紊亂，中央肝小葉壞死伴有炎細胞浸潤，肝細胞發生脂肪變性，小葉間可見纖維增生，見圖1B;模型6 周組:肝細胞脂肪變性加重，增生的纖維交織成網狀結構，炎細胞浸潤加重，見圖1C;模型8 周組:假小葉形成，見圖1D。

Figure 1. Pathological changes of hepatic tissues (HE staining，× 100). A:control ;B:liver cirrhosis at the 4th week ;C:liver cirrhosis at the 6th week ;D:liver cirrhosis at the 8th week.圖1 肝組織病理學改變

肺組織HE 染色顯示，正常肺組織肺泡結構完整，間隔均勻，見圖2A;模型4 周組，肺泡間隔略增厚，伴有巨噬細胞和噬中性粒細胞積聚，見圖2B;模型6 周組，肺泡間隔增厚，伴有毛細血管擴張，巨噬細胞及噬中性粒細胞積聚，部分肺泡腔變小，見圖2C;模型8 周組，肺泡間隔進一步增厚，隔內見管腔明顯增大的毛細血管以及大量聚集的巨噬細胞，肺泡腔進一步變小，見圖2D。

Figure 2. Pathological changes of pulmonary tissues(HE staining，× 400). A:control ;B:HPS at the 4th week ;C:HPS at the 6th week ;D:HPS at the 8th week.圖2 肺組織病理學改變

以上觀察和我所建立的肝硬化合并肝肺綜合征動物模型的病理變化結果相吻合［7］。

3 肺組織中GRP78 蛋白和mRNA 的表達

模型組GRP78 蛋白和mRNA 的表達隨病程進展而逐漸增加，且各時點間的表達有顯著差異(P ＜0.05)。在同一時點，模型組GRP78 蛋白和mRNA的表達也都顯著高于對照組(P ＜0.05)，見圖3、4 和表3、4。

Figure 3. The protein levels of GRP78 and GAPDH in pulmonary tissues. N:normal :A:HPS at the 4th week ;B:HPS at the 6th week ;C:HPS at the 8th week.圖3 GRP78 蛋白在肺臟的表達變化

Figure 4. The mRNA levels of GRP78 and GAPDH in pulmonary tissues. N:normal;A:HPS at the 4th week ;B:HPS at the 6th week ;C:HPS at the 8th week.圖4 GRP78 mRNA 在肺臟的表達變化

4 各指標間相關性分析

血漿內毒素的含量分別和血漿及肺組織勻漿TNF-α、MDA 的含量呈正相關(P ＜0.01)。肺組織GRP78 蛋白表達水平和血漿內毒素含量呈高度正相關(P ＜0.01)。肺組織中GRP78 蛋白與mRNA 的表達呈高度正相關(P ＜0.01)。肺組織GRP78 蛋白的表達水平分別與血漿及肺組織勻漿中MDA 和TNF-α 的含量呈正相關(P ＜0.01)，見表5。

表3 GRP78 蛋白在肺臟的表達變化Table 3. The protein level of GRP78 in the lung in normal control(NC)and HPS(M)groups (±s)

表3 GRP78 蛋白在肺臟的表達變化Table 3. The protein level of GRP78 in the lung in normal control(NC)and HPS(M)groups (±s)

Data were normalized to GAPDH as endogenous control. * P ＜0.05 vs NC ;△P ＜0.05 vs 4th week group ;#P ＜0.05 vs 6th week group.

Group n The 4th week The 6th week The 8th week NC 6 0.018±0.004 0.031±0.010 0.038±0.013 M 11 0.085±0.026* 0.134±0.044＊△ 0.215±0.074＊△#

表4 GRP78 mRNA 在肺臟的表達變化Table 4. The mRNA level of GRP78 in the lung in normal control(NC)and HPS(M)groups (±s)

表4 GRP78 mRNA 在肺臟的表達變化Table 4. The mRNA level of GRP78 in the lung in normal control(NC)and HPS(M)groups (±s)

Data were normalized to GAPDH as endogenous control. P ＜0.05 vs NC ;△P ＜0.05 vs 4th week group ;#P ＜0.05 vs 6th week group.

Group n The 4th week The 6th week The 8th week NC 6 0.843±0.004 0.956±0.025 0.989±0.012 M 11 1.179±0.031* 1.380±0.017＊△ 1.684±0.043＊△#

表5 各指標間相關性分析Table 5. Crrelation analysis of the indexes in HPS rats

討 論

復制理想的動物模型是研究人類疾病發病機制進而尋找有效治療策略的前提和基礎。本研究中，根據血漿ALT 水平以及肝組織和肺組織形態學的改變，我們認為肝肺綜合征的動物模型復制成功。

內質網是細胞中蛋白質加工和Ca2+貯存的重要細胞器。由于各種原因引起內質網中錯誤折疊蛋白與未折疊蛋白在腔內聚集和/或Ca2+平衡紊亂，可以導致內質網應激，通過未折疊蛋白反應途徑，增強細胞對損傷的抵抗及適應能力。GRP78 增加是內質網應激的重要標志，也是該過程中內質網穩態的主要調控者。近年研究發現，GRP78 又是與多種疾病發生密切相關的重要因子［8］。本項研究結果顯示:模型組動物肺組織中GRP78 蛋白和mRNA 表達在第4周即有所增加，并隨著病程進展逐漸增高，且二者之間的變化高度正相關，提示GRP78 的高表達和HPS的發病密切相關。

研究已經證實，內毒素是重要的內質網應激原［9］，它可以通過未折疊蛋白和/或Ca2+的聚集等多種途徑直接引起內質網應激［10，11］，也可以通過氧化應激間接誘導內質網應激，進而導致GRP78 表達增高。據報道，氧化應激可以抑制鈣泵功能，導致內質網中儲存的鈣離子減少或異常蛋白增多，誘發內質網應激［12，13］。我們前期研究證實，HPS 發病過程中肺組織中NO 表達增多，NO 與內毒素均可以促進活性氧產生［14，15］，后者攻擊分子伴侶或導致細胞內Ca2+聚集，激發內質網應激［16，17］，進一步參與疾病的發病過程。我們研究發現，模型組動物血漿內毒素水平隨病程進展逐漸升高，血漿及肺組織勻漿中促炎因子TNF -α 含量也逐漸升高，呈現出與內毒素一致的變化規律，二者與各時點肺組織中GRP78 蛋白的表達呈高度正相關，提示腸源性內毒素及其誘導產生的細胞因子是引起內質網應激以及GRP78 表達增高的重要因素。我們還發現血漿和肺組織勻漿中MDA(是脂質過氧化的中間產物，其含量可以反映氧自由基對生物膜的損害程度)含量隨病程進展逐漸升高，與內毒素變化趨勢一致，且高度相關，提示氧化應激是內毒素引起內質網應激的重要中間環節。前期工作中，我們已經利用肝硬化合并HPS 模型證實了腸源性內毒素在肝肺綜合征發病中的作用［1］，但對其機制探討有限;我們給正常大鼠腹腔注射小劑量內毒素(每天0.5 μg/g BW)4 d，發現肺組織中GRP78 蛋白表達較正常對照組動物顯著增加，并且肺泡腔內有大量巨噬細胞積聚(尚未發表)，這些結果揭示了內毒素與GRP78 高表達間的內在聯系以及它們在HPS 發病中的重要作用。由于有文獻報道GRP78 作為多功能受體參與了多種疾病的發生［8］，因此我們認為腸源性內毒素通過引起GRP78的高表達很可能是促進HPS 發病的重要機制。

肺臟是處于肝臟的“下游”器官，肝硬化時由于肝臟代謝障礙和生物轉化功能降低以及側枝循環的建立，導致各種毒物直接進入肺循環，腸源性內毒素是全部毒物中作用最強的物質。因而我們認為肝硬化時形成的腸源性內毒素血癥作為內質網應激的重要應激原，激活肺組織的內質網應激反應導致GRP78 表達增高可能是HPS 發病的關鍵。這一發現將為揭示HPS 發病的新機制，進而尋求有效的非手術治療途徑提供新思路。

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