淫羊藿苷改善糖尿病大鼠睪丸病變及其對轉化生長因子β1和Ⅳ型膠原蛋白酶表達的影響*

陳 凱， 蘇燕慧， 喻蘇青， 劉浩然， 齊敏友△

(1 浙江工業大學藥學院，浙江 杭州310014;2 湖南大學化學化工學院，湖南 長沙410082)

糖尿病是一種多代謝紊亂疾病，其并發癥可涉及多種器官。糖尿病所并發的生殖功能障礙是其臨床表現之一［1，2］，發病率是其他人群的5－10 倍，給患者的身心健康帶來嚴重的傷害。隨著糖尿病發病率的逐年上升，糖尿病并發的男性生殖功能損傷越來越受到社會的關注［3］，其發病機制尚未完全明了。淫羊藿苷(icariin)是小檗科(Berberidaceae)淫羊藿屬(Epinedium)植物淫羊藿莖葉中提取的總黃酮(total flavonoids)的主要有效成分，分子式為C33H40O15，分子量676.67，結構上屬于8－異戊烯基黃酮醇苷類化合物［4］?，F代藥理學研究證明，淫羊藿苷具有抗腫瘤、增強免疫功能、改善心腦血管功能、調節內分泌等多種藥理學作用［5］，但對糖尿病睪丸病變的作用尚未見報道。本實驗采用鏈脲佐菌素誘導大鼠1型糖尿病模型，研究淫羊藿苷對1 型糖尿病大鼠睪丸結構和功能的影響及其可能機制，為其臨床新用途提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 SD 雄性健康大鼠，體重180－200 g，(浙江醫學科學院實驗動物中心提供)。合格證號為SCXK(浙)2008－0033。

1.2 主要藥物及試劑 淫羊藿苷由西安小草植物科技有限公司提供，淡黃色粉末，純度98.25%;鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，Sigma 產品;考馬斯亮藍測試盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、γ－谷氨酰轉肽酶(γ－glutamyl transpeptidase，γ－GT)和琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)試劑盒均由南京建成生物工程有限公司提供;血糖和睪酮檢測試劑盒由天津九鼎生物工程有限公司提供;兔抗大鼠轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF－β1)抗體和Ⅳ型膠原蛋白(collagen Ⅳ)由武漢博士德公司提供。

1.3 主要儀器 血糖測定儀(美國強生公司);紫外分光光度計、離心機(鞏義市英峪予華儀器廠);電子天平(型號104，Mettler－Toledo Group);恒溫水浴箱(型號WB22);石蠟切片機(HITACHI);Image－Pro Plus 5.0 圖像分析軟件。

2 方法

2.1 模型建立及動物分組 雄性SD 大鼠分籠飼養，自由飲水。禁食12 h 后，于尾靜脈內注射STZ，劑量為40 mg·kg－1(用0.1 mol·L－1無菌檸檬酸緩沖液配制，pH 4.6)。72 h 后抽尾靜脈血測血糖，血糖＞16.7 mmol·L－1為糖尿病大鼠模型。正常組尾靜脈內注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠隨機分為正常組、模型組、淫羊藿苷組，每組10 只;于第4 周末開始灌胃，淫羊藿苷組以淫羊藿苷混懸液灌胃(混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉CMC－Na);正常組及模型組每天同體積羧甲基纖維素鈉灌胃。

2.2 標本收集與處理 實驗過程中各組均喂標準飲食，常規監測血糖，觀察體重變化，于12 周末處死各組大鼠，心臟取血，摘取雙側睪丸，稱其總質量，取其平均值(g)，與體質量之比(g)，即為睪丸質量系數(質量系數=臟器質量/體質量×100%)。右側睪丸組織置于10%中性甲醛以制作石蠟切片，用于病理檢查，左側睪丸組織保存于液氮中。

2.3 生化指標測定 將血標本離心10 min(2 000 r·min－1)，取血清，按試劑盒說明測睪酮。取左側睪丸組織以生理鹽水制成勻漿，檢測SDH、ACP、γ－GT和LDH 的活性。

2.4 組織學檢測 取右側睪丸組織以10%中性甲醛固定，沿其長軸垂直于曲細精管走向剖開，經石蠟包埋切片，HE 染色，于光鏡下觀察。

2.5 免疫組織化學染色 取各組大鼠睪丸組織石蠟包埋，4 μm 切片，烤片2 h，常規脫蠟至水，3%H2O2處理清除內源性過氧化物酶，抗原熱修復。用正常山羊血清封閉后，分別滴加兔抗大鼠TGF－β1、Ⅳ型膠原蛋白多單克隆抗體(1∶50)4℃孵育過夜。滴加Envision 工作液(武漢博士德公司，1∶50)室溫30 min。DAB 顯色，鏡下控制顯色程度后水洗。蘇木素襯染，經二甲苯透明后中性樹膠封片。定量分析:在高倍顯微鏡下(×400)隨機選取組織結構保存較好的精曲小管，用Image－Pro Plus 5.0 彩色病理圖像分析軟件進行分析，測定免疫組化陽性顆粒的平均吸光度值，并計算8 個視野吸光度的均值，對TGF－β1和Ⅳ型膠蛋白表達做半定量分析。

3 統計學處理

結 果

1 淫羊藿苷對血糖及睪丸質量系數的影響

模型組大鼠血糖明顯高于正常組(P ＜0.01)，使用淫羊藿苷后，血糖無明顯變化，見表1。模型組大鼠體重下降，睪丸質量系數增大，與正常組比較有顯著差異(P ＜0.01);淫羊藿苷組大鼠體重及睪丸質量系數較模型組有所改善，睪丸質量系數明顯降低(P ＜0.05)。

表1 淫羊藿苷對體重、血糖及睪丸質量系數的影響Table 1. Effects of icarrin on body weight(BW)，the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and blood glucose(±s.n=10)

表1 淫羊藿苷對體重、血糖及睪丸質量系數的影響Table 1. Effects of icarrin on body weight(BW)，the ratio of testis weight to body weight(TW/BW)and blood glucose(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.

Group BW(g) TW/BW(%) Glucose(mmol/L)Control 360.55±21.14 0.40±0.03 5.00±0.34 Model 165.33±11.15＊＊ 0.59±0.05＊＊ 19.85±3.07＊＊Icarrin 220.50±4.95## 0.44±0.06#16.37±3.94

2 淫羊藿苷對睪丸組織特異性酶SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睪酮水平的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠睪丸中SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睪酮水平明顯下降(P＜0.01)，而淫羊藿苷組大鼠睪丸中SDH、ACP、γ－GT、LDH 活性及血清睪酮水平較糖尿病有顯著提高(P ＜0.01)，見表2。

表2 淫羊藿苷對睪丸組織SDH、γ－GT、ACP、LDH 活性和睪酮水平的影響Table 2. Effects of icarrin on the activitiy of SDH，γ－GT，ACP and LDH and the level of testosterone in testicular tissues(±s.n=10)

表2 淫羊藿苷對睪丸組織SDH、γ－GT、ACP、LDH 活性和睪酮水平的影響Table 2. Effects of icarrin on the activitiy of SDH，γ－GT，ACP and LDH and the level of testosterone in testicular tissues(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs diabetic.

Group SDH(U·g －1 protein)γ－GT(U·g －1 protein)ACP(U·g －1 protein)LDH(U·g －1 protein)Testosterone(nmol·L －1)Control 29.92 ±4.72 51.50 ±6.74 101.23 ±17.38 4 005.42 ±600.70 33.88 ±2.61 Model 15.51 ±2.97＊＊ 27.47 ±8.07＊＊ 63.05 ±13.30＊＊ 2 832.64 ±428.32＊＊ 17.11 ±2.12＊＊Icarrin 25.18 ±4.21## 45.15 ±3.31## 89.72 ±14.76## 3 846.64 ±589.21## 23.49 ±2.55##

3 睪丸組織形態學改變

正常組小鼠睪丸各級生精細胞豐富，生精細胞與支持細胞排列有序;模型組睪丸各級生精細胞顯著減少，支持細胞少，甚至成空泡，細胞排列紊亂。淫羊藿苷組生精細胞相對模型組增多，排列較為整齊，與正常組較為接近，見圖1。

Figure 1. Pathological changes of rat testicular tissues from control (A)，model (B)，icarrin (C)groups (HE staining，×100).圖1 各組大鼠睪丸組織病理比較

4 睪丸組織中TGF－β1 和Ⅳ型膠原蛋白的變化

淫羊藿苷對大鼠生殖細胞TGF－β1和Ⅳ型膠原蛋白表達的觀察結果見圖2、3。TGF－β1和Ⅳ型膠原蛋白陽性表達主要見于圓形精子細胞以及支持細胞的胞質。與正常對照組比較，模型組表達顯著增加(P ＜0.01)，淫羊藿苷組的表達與模型組比較明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)。

討 論

對于糖尿病及其并發癥的動物模型的建立方法有多種，到目前為止，大部分對糖尿病睪丸組織病理變化的研究通常使用STZ 誘導的動物模型［6］。STZ為一種廣譜抗菌素，能特異性破壞胰島β 細胞，導致胰島素分泌減少，血糖升高。本研究證實，經STZ 溶液(40 mg·kg－1)一次性尾靜脈注射方法制備大鼠糖尿病模型［7］，模型組和用藥組大鼠的血糖均＞16.7 mmol/ L，多飲、多尿、多食、少重的“三多一少”癥狀明顯，24 h 尿量大于原尿量50%，顯示本研究中糖尿病睪丸病變模型是成功的。

糖尿病導致的睪丸功能和結構的損傷可以表現為其標志性酶類的變化［8］。睪丸中標志性酶ACP其活性的高低可作為衡量是否有生精障礙的指標，SDH 在精子能量代謝中起重要作用，LDH 促進能量代謝及生精上皮成熟，而γ－GT 則為精子成熟提供酸性環境［9］。本實驗研究結果顯示，STZ 誘導的糖尿病大鼠功能明顯損害。模型組睪丸系數顯著下降，睪丸特異性酶類活性的減弱。另外，病理組織學顯示曲細精管明顯減少，支持細胞少，甚至成空泡。淫羊藿苷組對上述表現都有不同程度的逆轉，提示淫羊藿苷可以保護酶的活性，防止各級生精細胞的損傷，促進生精細胞能量的生成，從而對糖尿病模型大鼠睪丸有保護作用。

Figure 2. Expression of TGF－β1 in testicular tissues of rats(immunohistochemical staining，×400).A:control;B:model;C:icarrin. ±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs A;##P ＜0.01 vs B.圖2 睪丸組織TGF－β1 的表達

Figure 3. Expression of collagen Ⅳin testicular tissues of rats(immunohistochemical staining，×400).A:control;B:model;C:icarrin.±s.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs A;#P ＜0.05 vs B.圖3 睪丸組織Ⅳ型膠原蛋白的表達

對生殖系統來講，睪酮水平在刺激性器官分化、發育并維持正常性功能方面均起重要作用［10］，睪酮促使精子發生和成熟，糖尿病可以使睪丸逐步出現病變，睪酮分泌減少，本實驗中糖尿病模型大鼠血清睪酮明顯減少，淫羊藿苷能在一定程度上恢復睪丸功能，促進睪酮分泌，進一步證明淫羊藿苷對糖尿病及其并發的性與生殖功能障礙有防治作用。

TGF－β1是糖尿病并發癥發展過程中起重要作用的一類生長因子［11］，表達于各種哺乳動物的睪丸中，與睪丸的生理功能密切相關。一些體內外研究中對糖尿病睪丸的保護藥物往往以此為評價，睪丸發病過程中各種損傷介質最終是通過誘導TGF－β1增加致睪丸損害。另外，TGF－β1能誘導基質蛋白的沉積［12］，同時刺激睪丸界膜中主要的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)分子Ⅳ型膠原蛋白的表達和產生［13］。Ⅳ型膠原作為ECM 的主要組分，構成睪丸基膜的結構支架，是ECM 增殖的主要成分。本研究免疫組化結果顯示模型組TGF－β1及Ⅳ型膠原蛋白表達顯著升高，與模型組相比，淫羊藿苷組TGF－β1及Ⅳ型膠原蛋白表達明顯減少。這提示淫羊藿苷最終是通過下調TGF－β1與Ⅳ型膠原途徑發揮其睪丸保護作用，但其作用機制尚有待進一步研究。

總之，本研究表明，淫羊藿苷對糖尿病大鼠睪丸具有一定的保護作用，機制可能與其促進睪酮分泌、抑制TGF－β1和Ⅳ型膠原蛋白表達有關。由于目前對糖尿病睪丸病變缺乏有效治療手段，因此積極研究淫羊藿苷治療糖尿病睪丸病的作用和機制具有重要意義。

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