外源性ADM對腎臟急性機械性損傷早期HPA軸的影響*

王曉梅， 張淑琴， 王曉燕， 王 芳， 孫少華△

(1蘭州大學第一醫院病理科，2甘肅省衛生學校，甘肅 蘭州730000;3西安郵電學院，陜西西安710121)

腎臟受到急性創傷因素刺激時，腎組織局部出現缺血、缺氧、氧化應激等病理生理改變，同時還可觸發創傷后機體一系列生理應激反應，尤其是下丘腦－垂體－腎上腺皮質(hypothalamus－pituitary－adrenal cortex，HPA)軸的激活，是機體重要的防御反應。腎上腺髓質素(adrenomedullin，ADM)是一種血管源性活性多肽。大量研究已證實在腎損傷及腎臟疾病中運用外源性ADM可起到切實的腎臟保護作用[1，2]。在中樞神經系統內ADM分布于植物神經調節中樞的相關核團，其中在丘腦和下丘腦的含量為最高，內源性ADM作為神經遞質或調質發揮生物學作用[3－5]。在急性腎損傷過程中運用外源性ADM，除了腎臟局部的保護作用，對機體應激反應(HPA軸)是否也有影響，起著何種作用，尚未見有文獻報道。因此，本實驗通過建立腎損傷動物模型，進行相關研究和探討。

材料和方法

1 動物及分組

3月齡健康清潔級Wistar大鼠104只，雌雄各半，體重(210±30)g，隨機分為4組:正常對照組8只。單純創傷組32只，創傷前給藥組32只，創傷后給藥組32只。后3組大鼠平均分為4批分別在機械打擊后1、6、12、24 h處死。

2 主要試劑及儀器

ADM購自Calbiochem，貨號為121703;促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)放免分析試劑盒和皮質醇(cortisol，CORT)放免分析試劑盒均購自北京北方生物技術研究所;促腎上腺皮質激素釋放激素(corticotropin－releasing hormone，CRH)Ⅰ抗、SABC免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司;生物撞擊儀由蘭州大學第一醫院病理研究所自行研制(無專利及批準，暫無型號);上海分析儀器廠生產的721分光光度計;Beckman Coulter AllegraTM64 R低溫離心機;西安二六二廠生產的FJ－2008型全自動γ－免疫計數儀;四川大學圖像圖形研究所Mias圖像分析系統。

3 ADM的配制和使用[6]

ADM使用前先用生理鹽水稀釋成50 nmol/L的母液，置于－20℃保存。實驗時按照0.1 nmol/kg計算每只動物所需的量，再以生理鹽水稀釋為0.5 mL終體積腹腔注射即可。

4 動物腎臟創傷模型的建立[7]

動物不經任何麻醉處理，采用俯臥位將其四肢固定于打擊臺上，以160 g鐵質打擊錘從45 cm高度自由下落打擊大鼠脊肋區，打擊面為圓形，直徑1 cm，下壓距離0.7 cm。造成雙側腎臟I級損傷(根據美國創傷外科學會器官損傷標準委員會制定的腎臟損傷標準)[8]。創傷前、后給藥組分別于打擊前后10 min腹腔注射ADM 0.1 nmol/kg。為避免晝夜節律的影響，各組動物均于晨8時在10%水合氯醛(3 mg/kg)深度麻醉下采用快速心臟采血法處死。

5 血漿的制備與檢測

取全血2 mL加 EDTA－Na2(1 g/L)和抑肽酶(5×108IU/L)預處理的試管中，3 000 r/min、40℃離心20 min，分離血漿，－40℃冰箱保存，由蘭州大學第一醫院核醫學科用放免分析法檢測血漿ACTH和CORT濃度。ACTH放免分析測定盒:標準范圍5－405 ng/L，靈敏度＜5 ng/L，準確性(回收率:91.7% －101.3%，平均回收率96.5%)，精密度(批內變異系數＜6%，批間變異系數＜12%);CORT放免分析藥盒:檢測范圍為 10－500 μg/L，靈敏度 ＜2 ng/L，精密度(批內變異系數＜10%，批間變異系數＜15%)。

6 下丘腦免疫組化

分離下丘腦(視交叉、乳頭體為前后界，左右下丘腦溝為左右側界，深約1－1.5 cm)，去除腦膜和血凝塊，10%中性甲醛固定，經脫水、透明、包埋后，常規切片(4 μm)。采用SABC法進行CRH免疫組化染色，DAB顯色，細胞內出現棕黃色顆粒為陽性結果。采用Mias圖像分析系統對CRH的表達進行面積和灰度值測量。

7 統計學處理

采用SPSS 10.0統計學軟件分析及處理數據，數據以均數±標準差(±s)表示。各指標均采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法。

結 果

實驗中大鼠共死亡6只:單純創傷組1只，創傷前給藥組2只，創傷后給藥組3只。

1 大鼠創傷后下丘腦CRH表達的改變

單純創傷組的大鼠下丘腦CRH在創傷后不同時點的表達與正常對照組相比均無顯著差異。創傷前注射ADM使CRH的表達在各時點均有所升高，其中1、24 h升高的幅度更大，與正常對照組和單純創傷組相比均顯著差異，6、12 h無明顯影響。創傷后注射ADM使CRH的表達在1、6、12 h與正常對照組和單純創傷組相比均顯著升高，24 h無明顯影響，見圖1。

2 大鼠創傷后血漿ACTH的改變

單純創傷組的大鼠血漿ACTH濃度在創傷后不同時點的表達與正常對照組相比均無顯著差異。創傷前注射ADM使大鼠血漿ACTH濃度在創傷后12 h明顯高于正常對照組和單純創傷組;在創傷后1 h、6 h和24 h，各組之間均無顯著差異。創傷后注射ADM則對各組大鼠血漿ACTH濃度均無明顯影響，任一時點各組之間均無顯著差異，見圖2。

Figure 1.Expression of CRH in rat hypothalamus after trauma.±s.*P ＜0.05 vs trauma group;△P ＜0.05 vs control group.圖1 大鼠創傷后下丘腦CRH的表達

Figure 2.Concentration of ACTH in rat plasma after trauma.±s.*P ＜0.05 vs trauma group;△P ＜0.05 vs control group.圖2 大鼠創傷后血漿ACTH濃度的改變

3 大鼠創傷后血漿CORT的改變

單純創傷組的大鼠血漿CORT濃度在創傷后不同時點的表達與正常對照組相比均無差異顯著。創傷前注射ADM使大鼠血漿CORT濃度在6、12和24 h均顯著升高，與正常對照組相比均差異顯著，而在創傷后12 h升高的幅度最大，與單純創傷組相比也有顯著差異;1 h無明顯影響。創傷后注射ADM則使大鼠血漿CORT濃度在12、24 h均明顯升高，與正常對照組相比均差異顯著，而在創傷后12 h升高的幅度最大，與單純創傷組相比也差異顯著;1、6 h無明顯影響，與正常對照組和單純創傷組相比均無顯著差異，見圖3。

討 論

1 HPA軸在急性創傷過程中的調節作用

Figure 3.Concentration of CORT in the rat plasma after trauma.±s.*P＜0.05 vs trauma group;△P＜0.05 vs control group.圖3 大鼠創傷后血漿CORT濃度的改變

本實驗檢測了大鼠下丘腦CRH的表達、血漿ACTH、CORT的濃度，以評價大鼠腎機械性損傷后HPA軸的激活情況。從統計結果來看，單純創傷后CRH和ACTH在12 h均有升高趨勢，但無顯著差異。CORT在創傷后6 h、12 h和24 h均有升高趨勢，亦無顯著差異。其主要原因可能是應激原的強度不足和應激原作用于機體的持續時間較短，不足以引起HPA軸的激活。本實驗施加給大鼠的打擊強度較弱，只達到I級腎創傷，持續時間短暫，自由落體的打擊錘落下時打擊到作用部位，打擊錘反彈后即刻停止。這樣只能引起HPA軸輕微的活動，即CRH、ACTH和CORT在創傷后輕微升高但無統計學意義。

雖然不能得出本次實驗中單純創傷后期腎組織損傷的恢復與HPA軸激活以及腎上腺皮質激素的防御代償有關的結論，但CRH、ACTH和CORT的變化趨勢符合機體遭受創傷時的病理生理過程，即有一定的病理生理意義。

2 外源性ADM對HPA軸的調節作用

2.1 外源性ADM可激活HPA軸的活動 既往的研究表明中樞給予 ADM，可提高血漿 ACTH[7]以及 CORT[8]的水平;在應激性高血壓大鼠的HPA軸檢測到ADM及其受體基因表達上調[9]。本實驗結果為:創傷前、后注射ADM均能使某個時點CRH、ACTH、CORT濃度顯著升高，即能不同程度地刺激HPA軸的各個層面，這表明外源性ADM通過其對HPA軸的各個水平的刺激作用加強了HPA軸的活性，在應激激素調節和應激生理反應中起著一定作用，進而發揮了對創傷腎組織的保護作用。

2.2 外源性ADM對HPA軸各個層面的激活作用不同 我們在實驗中發現外源性ADM刺激CRH、ACTH、CORT升高的時點不同，并且在高水平持續的時間也不相同。其對下丘腦分泌CRH和腎上腺皮質分泌CORT的刺激作用出現的時點比較早而且持續在高水平的時間比較長，而對腺垂體分泌ACTH的刺激作用只出現在創傷前給藥組的12 h。這說明HPA軸的各個層面對外源性ADM的反應性并不相同，即處于HPA軸兩端的下丘腦和腎上腺皮質對ADM的反應較敏感，而處于中間位置的腺垂體的反應性相對較差。

2.3 創傷前和創傷后外源性ADM對HPA軸的影響不同創傷前10 min注射ADM，打擊腎臟時外源性ADM剛好處于半衰期之內[10]，外源性ADM致HPA軸的興奮性增高，故出現傷后1 h下丘腦CRH的表達顯著增高。而該組血漿CORT濃度在6、12和24 h持續升高，一方面，CRH表達的增高，通過HPA軸，促進靶器官CORT產生;另一方面是ADM發揮局部保護作用，使腎臟創傷初期的組織缺血缺氧減輕，從而能更好應答應激激素水平的調節。傷后6 h及12 h中樞CRH表達水平的回落一方面考慮是外源性ADM的消耗減少;另一方面此時點血漿CORT濃度的升高產生負反饋效應。至創傷后24 h，內源性ADM生成增加，致CRH再次升高。

創傷后10 min注射ADM使CRH的表達在創傷早期顯著增高并且持續時間較長(1 h、6 h、12 h)，一方面創傷后即刻的血管反應和交感活性的增加已經對組織造成了一定的損傷，引起HPA軸輕微的活動，并產生一定水平的內源性ADM，與外源性ADM產生的生理效應相疊加，促進中樞CRH表達增加，并在創傷后12 h達到最高峰。創傷后注射的外源性ADM對已經產生的組織損傷無逆轉作用，致創傷局部反應減弱，因而血漿CORT水平的升高在創傷后期(12、24 h)才出現。

據此分析，創傷后注射ADM對下丘腦分泌CRH的激活作用更強，但創傷前注射ADM比創傷后注射ADM能更好刺激腎上腺皮質分泌CORT，發揮對創傷腎組織的保護作用。

通過以上實驗，我們發現急性腎損傷后運用外源性ADM可活化HPA軸，提高機體的應激防御水平，再加上其在腎臟局部的擴血管、抗氧化、減少內皮細胞滲漏等效應，對創傷機體發揮調控和保護作用。

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