ADM和ADT對肺動脈平滑肌細胞膠原合成及磷酸化ERK1/2表達的影響*

張 磊， 趙翠芬△， 李福海， 王 榮， 夏 偉

(山東大學1齊魯醫院兒科，2衛生部教育部心血管功能重塑與功能研究重點實驗室，山東濟南250012)

肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)肥大、增殖，膠原等細胞外間質在肺血管壁沉積導致肺血管壁增厚、管腔狹窄是肺血管重構主要的病理生理改變之一[1]。腎上腺髓質素(adrenomedullin，ADM)是一種血管活性多肽，ADM前體(proadrenomedullin，proADM)在體內經內源性肽酶的作用可以降解產生4個不同的活性肽段，各肽段在肺內的分布和作用不同[2]，其中ADM可擴血管、抑制平滑肌細胞增殖和遷移，腎上腺加壓素(adrenotensin，ADT)可收縮血管、升高血壓和促進血管平滑肌細胞增殖和遷移[3]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)是各種刺激引起細胞增殖的細胞內信息傳遞的共同通路，研究發現細胞外信號調節激酶(extracellular signalregulated kinase，ERK)參與了高肺血流大鼠肺血管重構的形成過程[4]。本研究探討ADM和ADT對培養的Wistar大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原合成及磷酸化ERK1/2(p－ERK1/2)表達的影響，揭示ADM和ADT調節PASMCs增殖的可能機制。

材料和方法

1 材料

1.1 儀器和試劑 4周齡雄性Wistar大鼠(重約100 g)，購自山東大學醫學院實驗動物中心。山羊抗小鼠－TRITC和山羊抗小鼠－FITC(Sigma)，小鼠抗人平滑肌α－actin單克隆抗體(R＆D)，ADM和ADT(北京中杉)，兔抗大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原抗體和兔抗大鼠p－ERK1/2抗體(北京博奧森)。實驗用儀器、設備及其它試劑均由山東大學教育部和衛生部心血管重構與功能研究重點實驗室提供。

1.2 試劑配制 D－Hanks平衡鹽溶液:稱取 KCl 0.4 g、KH2PO40.06 g、NaCl 8.0 g、NaHCO30.35 g、Na2HPO4·12H2O 0.134 g和酚紅0.01 g溶解于三蒸水1 000 mL中，調pH值至7.2－7.4，過濾除菌，分裝后4℃保存。PBS緩沖液:稱取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、1.15 g Na2HPO4·7H2O 和 0.2 g KH2PO4溶解于1 000 mL三蒸水中，調pH值至7.3，過濾除菌，分裝后4℃保存。以上試劑經0.22 μm濾膜過濾除菌。培養基:80%高糖D MEM和10%FBS、10%G418過濾除菌。

2 方法

2.1 大鼠PASMCs分離及培養 采用組織貼塊法培養雄性Wistar大鼠PASMCs，2%戊巴比妥麻醉(40 mg/kg)，75%乙醇浸泡3 min，開胸取心肺，PBS沖洗2遍;在超凈臺內用顯微剪及顯微鑷循肺動脈主干逐級追入肺實質，取肺動脈2級以下分支，冷PBS清洗2遍。冷PBS液中剝除外膜纖維脂肪層，縱向剪開血管，內面朝上彎頭小鑷子自上而下刮除內膜，留中膜平滑肌層。用眼科剪將中膜剪成約1 mm×1 mm×1 mm的小塊;用彎頭吸管將小組織塊移入50 mL培養瓶中，并均勻鋪于培養瓶底，每瓶25－30個組織塊;小心加入含20%FBS的高糖DMEM培養基5 mL，倒置于CO2孵箱中3－6 h，待組織塊貼壁牢固后，翻正培養瓶使組織塊完全浸泡于培養液中;放入CO2孵箱(37℃、5%CO2、95%空氣，保持一定濕度)繼續培養4－7 d后，于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。待原代細胞生長至匯合狀態、鋪滿瓶壁的80%以上時，進行傳代。實驗用4－7代平滑肌細胞。

2.2 PASMCs免疫熒光鑒定 采用平滑肌α－actin單克隆抗體對培養的細胞進行鑒定。將第4代的細胞消化后移入6孔板，在37℃、5%CO2培養箱中靜止培養。按說明書進行操作，分別加入小鼠抗人血管平滑肌細胞單克隆抗體(1∶500)，0.01 mol/L PBS作陰性對照，滴加TRITC標記山羊抗小鼠IgG(1∶500)孵育30 min 37℃ 濕盒;DAPI染細胞核1－2 min;防淬滅封片，鏡下觀察。

2.3 免疫熒光檢測ADM和ADT對大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達的影響 取4－7代PASMCs，酸處理蓋玻片放入6孔板內做細胞爬片，分別加入:10－7mol/L ADM或ADT和兔抗Ⅰ型膠原抗體(1∶200);10－7mol/L ADM或ADT和兔抗Ⅲ型膠原抗體(1∶200);10－7mol/L ADM或ADT和兔抗p－ERK1/2抗體(1∶100);10－7mol/L ADM 或 ADT和0.01 mol/L PBS作陰性對照。滴加FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1∶100)，37℃孵育30 min。每組10孔，培養72 h，4%多聚甲醛固定，作免疫熒光分析，每張爬片在熒光顯微鏡下(×400)隨機選取5個視野拍照，觀察細胞漿出現綠色顆粒者為陽性細胞。采用Image－Pro Plus 5.0圖像處理軟件對結果進行圖像分析處理，分析相同曝光時間下的吸光度(absorbance，A)值。

2.4 細胞總蛋白提取和免疫印跡 采用Western blotting檢測不同濃度的ADM和ADT對培養細胞之p－ERK1/2蛋白表達的影響:以下操作均在冰上或4°C進行，所有液體預先致冷。分別加入 10－7mol/L、10－8mol/L 和 10－9mol/L ADM或ADT，培養到規定時點收集細胞(貼壁細胞胰酶消化)，用PBS洗滌細胞2次，并轉移入EP管，1 000 r/min離心5 min棄盡上清液;將細胞沉淀重懸于細胞裂解液，冰浴40 min;18 000 r/min離心10 min，收集上清，即為細胞總蛋白。取20 μL總蛋白先經12%SDS－PAGE分離，再電轉移至硝酸纖維素膜 (Amersham Pharmacia)上，用含0.05%Tween－20、5%脫脂奶粉的Tris緩沖液(TBS－T，5%non－fat milk)將膜室溫封閉2 h后，加入相應的第Ⅰ抗體，4℃孵育過夜。用TBS－T洗膜3次，每次10 min。然后，將膜用相應第Ⅱ抗體室溫孵育2 h。TBS－T洗膜3次，每次10 min。ECL化學發光系統顯色，壓片、曝光、顯影、定影后晾干保存。采用Image－Pro Plus 5.0圖像處理軟件對結果進行圖像分析處理，分析相同曝光時間下的A值。

3 統計學處理

結 果

1 培養大鼠遠端PASMCs鑒定

細胞培養3－5 d后，用相差顯微鏡觀察見細胞呈梭形或長梭形排列，然后細胞呈放射性生長，多為兩極，胞漿均勻，可見圓形細胞核及分裂相。培養至7－10 d出現局部成束的細胞平行排列，部分區域細胞重疊，部分區域高低起伏呈“峰－谷”狀生長。用小鼠抗人α－actin抗體及TRITC標記的山羊抗小鼠抗體鑒定為平滑肌細胞，見圖1。細胞質發紅色熒光(A1)，細胞核發藍色熒光(A2)，A3為A1和A2合成圖。細胞純度平均達97%以上。

Figure 1.Immunofluorescence identification of rat PASMCs(inverted phase－contrast microscope，×200).A1:cell cytoplasm was stained with TRITC shown in red;A2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;A3:overlap of A1 and A2.圖1 大鼠PASMCs免疫熒光

2 免疫熒光檢測ADM和ADT對大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達的影響

2.1 10－7mol/L ADM和ADT對PASMCsⅠ型膠原表達的影響 圖2中細胞質圖B1發暗綠色、圖C1發亮綠色熒光，細胞核(B2、C2)發藍色熒光，B3、C3為合成圖。這提示:ADM可抑制培養 PASMCsⅠ型膠原的表達。而 ADT可增強PASMCsⅠ型膠原表達。

2.2 10－7mol/L ADM和ADT對PASMCsⅢ型膠原表達的影響 圖3中細胞質圖D1發暗綠色熒光、圖E1發亮綠色熒光，細胞核(D2、E2)發藍色熒光，D3、E3為合成圖。這提示:ADM可抑制PASMCsⅢ型膠原的表達;ADT可增強培養PASMCsⅢ型膠原的表達。

2.3 10－7mol/L ADM 和 ADT對 PASMCs p－ERK1/2表達的影響 圖4中細胞質圖F1發暗綠色熒光、圖G1發亮綠色熒光，細胞核(F2、G2)發藍色熒光，F3、G3為合成圖。這提示:ADM可抑制PASMCs p－ERK1/2的表達，而ADT可增強培養PASMCs之p－ERK1/2的表達。

2.4 吸光度比值分析 10－7mol/L ADM和 ADT對大鼠PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達的影響 從表1中看出:吸光度比值顯示ADM可抑制培養PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2表達(P＜0.05，P＜0.01)，而 ADT可增強PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及 p－ERK1/2表達(P＜0.05，P＜0.01)。這提示 ADM對PASMCs膠原合成有促進作用，而ADT可抑制PASMCs膠原合成。

3 Western blotting檢測ADM和ADT對PASMCs p－ERK1/2蛋白表達的影響

ADM可呈劑量依賴性抑制PASMCs p－ERK1/2蛋白表達(P＜0.01，P＜0.05);ADT也呈劑量依賴性促進PASMCs p－ERK1/2蛋白表達(P＜0.01，P＜0.05)，見圖5。這提示p－ERK1/2在PASMCs增殖過程中被激活，ADM和ADT可能通過ERK通路調節PASMCs增殖。

Figure 2.The effects of 10－7mol/L ADM(B1－3)and 10－7mol/L ADT(C1－3)on the expression of collagen typeⅠin cultured PASMCs(immunofluorescence staining，×400).B1 and C1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;B2 and C2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;B3:overlap of B1 and B2;C3:overlap of C1 and C2.圖2 10－7mol/L ADM和ADT對培養PASMCsⅠ型膠原表達的影響

Figure 3.The effects of 10－7mol/L ADM(D1－3)and 10－7mol/L ADT(E1－3)on the expression of collagen typeⅢ in cultured PASMCs(immunofluorescence staining，×400).D1 and E1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;D2 and E2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;D3:overlap of D1 and D2;E3:overlap of E1 and D2.圖3 10－7mol/L ADM和ADT對培養PASMCsⅢ型膠原表達的影響

Figure 4.The effects of 10－7mol/L ADM(F1－3)and 10－7mol/L ADT(G1－3)on the expression of p－ERK1/2 in cultured PASMCs(immunofluorescence staining，×400).F1 and G1:cell cytoplasm was stained with FITC shown in green;F2 and G2:cell nuclei were stained with DAPI shown in blue;F3:overlap of F1 and F2;G3:overlap of G1 and G2.圖4 10－7mol/L ADM和ADT對培養PASMCs p－ERK1/2表達的影響

表1 10－7mol/L ADM和ADT對培養PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原和p－ERK1/2表達的影響Table 1.The effects of 10－7mol/L ADM and ADT on the expression of collagen typeⅠ，Ⅲ and p－ERK1/2 in cultured PASMCs(A.±s.n=10)

表1 10－7mol/L ADM和ADT對培養PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原和p－ERK1/2表達的影響Table 1.The effects of 10－7mol/L ADM and ADT on the expression of collagen typeⅠ，Ⅲ and p－ERK1/2 in cultured PASMCs(A.±s.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

Group Collagen typeⅠ Collagen typeⅢp－ERK1/2 ADM 0.713±0.030＊＊ 0.514±0.020＊＊ 0.912±0.040＊＊ADT 1.210±0.020* 1.015±0.030* 1.414±0.030*Control 1.002±0.040 0.812±0.040 1.214±0.040

討 論

膠原是細胞外基質的主要成分，血管壁主要存在Ⅰ、Ⅲ型膠原，Ⅰ型膠原與血管壁抗張力有關，Ⅲ型膠原與血管壁彈性有關。細胞外基質增加是肺動脈高壓和肺血管重構的重要病理生理改變之一，血管壁中膠原蛋白堆積可導致肺動脈管壁增厚、管腔縮小，從而在缺氧性肺血管結構重構形成中起著十分重要的作用[5]。

Figure 5.Western blotting detected the effects of different concentrations of ADM(A)or ADT(B)on the protein expression of p－ERK1/2 in cultured rat PASMCs.β － actin served as internal control.Absorbance data were shown in C and D，respectively.ADM1，ADM2 and ADM3:10 －7mol/L，10 －8mol/L and 10 －9mol/L ADM;ADT1，ADT2 and ADT3:10－7mol/L，10－8mol/L and 10－9mol/L ADT.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 Western blotting檢測不同濃度的ADM或ADT對大鼠PASMCs p－ERK1/2蛋白表達的影響

本研究采用貼塊法原代體外培養大鼠遠端PASMCs[6]，雖然培養周期較長，但方法簡單、經濟，生長狀態良好，經傳代后可獲得較多的細胞數量，經小鼠抗人平滑肌α－actin單克隆抗體對培養細胞進行鑒定其細胞純度達97%。幼齡大鼠原代培養成功率高，但血管小，血管壁薄，細胞分離難度大，而老齡大鼠的細胞活力弱，生長緩慢，不適合細胞傳代生長，故實驗選擇4周齡、健康雄性大鼠。肺血管重構主要發生于遠端肺小動脈，表現為肺小動脈平滑肌細胞增殖、中膜增厚、無肌型肺小動脈肌化、微血栓形成、管腔狹窄等，故本研究選擇大鼠遠端PASMCs進行培養。

ADM是具有擴血管、抗細胞增殖和遷移作用的血管活性多肽，以旁分泌和自分泌形式參與許多生理和病理過程。ADT可抑制ADM的血管活性，顯示縮血管和促進血管平滑肌細胞增殖作用。研究證實ADM與ADT均參與了缺氧性肺血管重構過程[7]。新近動物實驗研究發現ADM既可延緩肺血管重構，又能逆轉肺血管重構，顯示了令人鼓舞的實驗效果[8]。

本研究結果顯示培養的PASMCs給予ADM刺激后，其胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達較對照組均減弱，而給予ADT刺激后PASMCs胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達較對照組增強。提示ADM可抑制培養的 PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原的合成。推測ADM可能通過抑制PASMCs增殖，使細胞數量減少;從基因轉錄水平上抑制了PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，下調了每個PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白合成的水平，導致膠原合成減少。膠原纖維是細胞質的基質成分之一，研究發現在培養平滑肌細胞中加入ADM可降低細胞遷移，抑制微管過度聚集，對抗胞質骨架過度穩定，從而延緩或抑制SMCs的肥大、增殖和遷移[9]。ADM還可能通過對PASMCs細胞質基質的表達和蛋白合成的調節作用來降低細胞漿中Ⅰ、Ⅲ型膠原表達。另外ADM可激活平滑肌細胞陽離子通道而使細胞超極化，細胞內鈣水平降低;同時可活化磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B/Akt，使eNOS磷酸化而使其活性增強，PASMCs收縮力降低，延緩細胞肥大，減少膠原等細胞基質分泌[10]。ADM基因修飾的內皮祖細胞轉錄到肺動脈高壓大鼠肺組織中可明顯降低肺動脈壓力，抑制平滑肌細胞重構[11]。研究還證實ADM吸入或靜脈注射均能降低肺動脈高壓病人的肺動脈壓力和肺血管阻力，逆轉肺血管肥厚[12]。ADT則可能從基因轉錄水平上增強Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達，上調了每個細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成水平，減緩了PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原蛋白的降解，從而使培養的大鼠PASMCs內Ⅰ、Ⅲ型膠原含量增加。

MAPKs通路為多種細胞外信號從細胞表面受體傳向細胞內的一條重要信號轉導通路。已被完全證實的轉導通路有3條:應力活化蛋白激酶(SAPK)、ERK和甘油高滲性激酶(HOG1)[13]。ERK與細胞增殖反應有關，許多促增殖活性物質，分別通過激活受體酪氨酸激酶和G蛋白途徑，相繼引起Ras、MAPK激酶激活，后者激活轉錄因子、刺激與細胞增殖有關的基因轉錄，促進細胞的生長、分化與增殖[14]。研究已證實MAPK在VSMCs增殖、分化、凋亡、細胞骨架等重構及細胞周期中起著非常重要的作用，MAPK可激活轉錄因子，增加PASMCs的DNA合成，促進細胞增殖和遷移[15]。

本研究結果顯示ADM可抑制培養的PASMCs p－ERK1/2表達;而 ADT促進培養的 PASMCs內p－ERK1/2表達，二者均隨濃度增加作用增強。提示ERK/MAPK途徑在PASMCs增殖中被激活，激活的p－ERK1/2可通過核轉位，啟動并上調PASMCs增殖基因，最終導致PASMC增殖。ADM具有抑制細胞增殖作用，ADM可以與特異性受體相結合引起細胞內cAMP升高，通過cAMP或cGMP的介導而抑制細胞增殖[16];ADM還可能通過直接抑制 ERK/MAPK信號通路，切斷信號通路下游與增殖有關的激酶，抑制轉錄因子功能，從而抑制細胞分化、增殖[17]。ADT可能通過激活ERK/MAPK信號通路，激活信號通路下游與增殖有關的激酶，增強轉錄因子功能，增強細胞分化與增殖。

總之，本研究通過原代培養Wistar大鼠PASMCs，檢測ADM和ADT對PASMCsⅠ型和Ⅲ型膠原合成及p－ERK1/2表達的影響，研究結果發現ADM可促進PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2的表達，而ADT可抑制PASMCsⅠ、Ⅲ型膠原及p－ERK1/2的表達。推測ERK信號途徑在PASMCs增殖過程中被激活，ADM和ADT可能通過ERK途徑調節PASMCs增殖。ADM或ADT拮抗劑估計可延緩或阻抑肺動脈高壓和肺血管重構的形成和發展。

[1]Rabinovitch M.Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension [J].J Clin Invest，2008，118(7):2372－2379.

[2]趙翠芬，王麗娟，王志宇，等.腎上腺髓質素前體不同活性肽段在肺動脈高壓大鼠肺內的分布[J].中國病理生理雜志，2008，24(4):655 －660.

[3]Kitamura K，Kangawa K，Kawamoto M，et al.Adrenomedullin:A novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma[J].Biochem Biophys Res Commun，1993，192(2):553 －560.

[4]趙翠芬，王麗娟，高 莉，等.腎上腺髓質素和升壓素在左向右分流肺血管重構中的變化及作用途徑研究[J].中華兒科雜志，2008，46(8):585 －590.

[5]Du J，Yan H，Wei B，et al.Effect of L－arginine on collagen of high flow－induced pulmonary arterial remodeling[J].Circ J，2005，69(5):603 －608.

[6]洪 城，王 健，李 冰，等.大鼠遠端肺動脈平滑肌細胞分離與原代培養[J].中華生物醫學工程雜志，2007，13(3):176 －179.

[7]Nakanishi K，Osads M，Uenoyama F，et al.Expression of adrenomedullin mRNA and protein in rats with hypobaric hypoxia－induced pulmonary hypertension[J].Am J Physiol Heart Cir Physiol，2004，286(6):H2159 －H2168.

[8]Stenmark KR，Rabinovitch M.Emerging therapies for the treatment of pulmonary hypertension[J].Pediatr Crit Care Med，2010，11(2 Suppl):S85 － S90.

[9]Sackett DL，Ozbun L，Zudaire E，et al.Intracellular proadrenomedullin－derived peptide decorate the microtubules and contribute to cytoskeleton function[J].Endocrinology，2008，149(6):2888 －2898.

[10]Murakami S，Kimura H，Kangawa K，et al.Physiological significance and therapeutic potential of adrenomedullin in pulmonary hypertension[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets，2006，6(2):125 －132.

[11]Zhao YD，Courtman DW，Deng Y，et al.Rescue of monocrotaline－induced pulmonary arterial hypertension using bone marrow－derived endothelial－like progenitor cells:efficacy of combined cell and eNOS gene therapy in established disease[J].Circ Res，2005，96(4):442 －450.

[12]Nagaya N，Kyotani S，Uematsu M，et al.Effects of adrenomedullin inhalation on hemodynamics and exercise capacity in patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension[J].Circulation，2004，109(3):351 －356.

[13]Yang X，Lee PJ，Long L，et al.BMP4 induced HO －1 via a Smad－independent，p38MAPK－dependent pathway in pulmonary artery myocytes[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2007，37(5):598 －607.

[14]Nagaya N，Kangawa K.Adrenomedullin in the treatment of pulmonary hypertension [J].Peptides，2004，25(11):2013－2018.

[15]Roberts PJ，Der CJ.Targeting the Raf－MEK －ERK mitogen－activated protein kinase cascade for the treatment of cancer[J].Oncogene，2007，26(22):3291 －3310.

[16]Zhao C，Wang L，Gao L，et al.Changes and distributions of peptides derived from proadrenomedullin in left to right shunt pulmonary hypertension of rats[J].Circ J，2008，72(3):476 －481.

[17]Zeng Z，Li Y，Jiang Z，et al.The extracellular signalregulated kinase is involved in the effects of sildenafil on pulmonary vascular remodeling [J].Cardiovasc Ther，2010，28(1):23－29.