CREG基因沉默誘導小鼠ESCs來源的EBs自發性凋亡*

張 娜， 韓雅玲， 田孝祥， 李 杰， 彭程飛， 閆承慧

(沈陽軍區總醫院，全軍心血管病研究所，遼寧 沈陽110016)

胚胎干細胞(embryonic stem cells，ESCs)是從胚胎早期內細胞團分離得到的全能干細胞[1]。在小鼠ESCs分化過程中，去除ESCs的飼養層細胞和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)并將其懸浮培養，ESCs可聚集成團，自發地分化形成具有3個胚層的胚胎小體(embryoid bodies，EBs)[2]。胚胎發育早期，EB內層細胞自發性凋亡是三胚層結構發生及胚胎發育的重要過程之一。如果EB細胞自發性凋亡現象出現異常，則可能引起胚胎早期發育過程紊亂致使胚胎發育受到抑制或發生早期胚胎死亡。因此，探討ESCs分化過程中EBs抗凋亡和促凋亡機制，可能為闡明胚胎發育機制提供新的思路。

E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A－stimulated genes，CREG)是從子宮頸內膜癌HeLa細胞cDNA文庫中克隆的一個新的轉錄相關調控因子[3]。已有研究表明，CREG促進胚胎細胞或不成熟細胞的分化成熟，在成熟組織和細胞中高表達，而在未成熟細胞如干細胞、人胚胎瘤細胞及未分化的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)中低表達[4－7]。我們新近研究發現，CREG在體外培養的骨髓間充質干細胞中過表達時能夠有效抑制缺氧誘導的細胞凋亡現象的發生[8，9];在損傷血管中過表達CREG能夠維持VSMCs的分化表型，對抗損傷后VSMCs凋亡的發生;CREG對抗VSMCs凋亡的作用是通過其下游 p38 MAPK信號轉導通路介導的[10]。另外，CREG在胚胎發育早期E5.5 d表達，提示其參與了胚胎發育的調控[6]。但CREG基因沉默對于ESCs早期發育中細胞凋亡的調控作用尚不清楚。因此，本實驗以ESCs衍生的EBs為研究模型，探討CREG基因沉默在EBs凋亡中的作用。

材料和方法

1 材料

昆明小鼠購自沈陽軍區總醫院動物中心;小鼠胚胎干細胞株R1(SCRC－1011TM)和小鼠成纖維細胞株STO(CRL－1503TM)購自ATCC;pEN_mH1c和pDS_hpEy載體由美國新澤西州立大學李少華教授饋贈;ES級胎牛血清(FCS)和DMEM干粉培養基購自Gibco;胰蛋白酶、EDTA、非必需氨基酸、β－巰基乙醇、丙酮酸鈉、Triton X－100和明膠購自Sigma;谷氨酰胺購自Gibco;重組人白血病抑制因子購自Chemicon;絲裂霉素C購自日本協和株式會社;Annexin VFITC凋亡檢測試劑盒購自BD;抗cleaved caspase－3抗體和抗CREG抗體購自RD;堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)染色試劑盒購自 Invitrogen;RTPCR檢測試劑盒及引物合成為TaKaRa。

2 方法

2.1 CREG基因shRNA載體的構建 小鼠CREG基因沉默表達載體pDS－shCREG由本室構建。簡述如下:應用RNA干擾在線設計工具設計4對可與小鼠CREG基因cDNA結合的短發夾RNA，具體序列如下:CREG－shRNA1:正義鏈5'－GATCCCCCAAGACAGAAGAGGACTATTTCAAGAGAATAGTCCTCTTCTGTCTTGTTTTTC －3'，反 義 鏈 5'－TCGAGAAAAACAAGACAGAAGAGGATCTATTGAAATAGTCCTCTTCTGTCTTGGGG－3';CREG－shRNA2:正義鏈 5'－GATCCCCTCGCGGACATCATCTCAATTTCAAGAGAATTGAGATGATGTCCGCGATTTTTC－3'，反義鏈 5'－TCGAGAAAAATCGCGGACATCATCTCAATTCTCTTGAAATTGAGATGATGTCCGCGAGGG－3';CREG－shRNA3:正義鏈5'－GATCCCCCTGGCCACTATCTCCACAATATTCAAGAGATATTGTGGAGATAGTGGCCAGTTTTTC －3'，反義鏈 5'－TCGAGAAAAACTGGCCACTATCTCCACAATATCTCTTGAATATTGTGGAGATAGTGGCCAGGGG－3';CREG－shRNA4:正義鏈 5'－GATCCCCGAATGAATCCTTCAGTCGAGGTTCAAGAGACCTCGACTGAAGGATTCATTCTTTTTC －3'，反義鏈5'－TCGAGAAAAAGAATGAATCCTTCAGTCGAGGTCTCTTGAACCTCGACTGAAGGATTCATTCGGG－3'。通過化學合成法合成并克隆至pEN_mH1c載體中，與目的載體pDS－hpEY進行LR重組得到4種表達不同shCREG片段的表達載體 pDS － shCREGs[11]。

2.2 ESCs培養、轉染及陽性克隆的篩選 ESCs用含15%FCS的DMEM培養基，37℃、5%CO2，恒溫培養箱中培養。STO為飼養細胞，培養基中加入LIF以保持細胞全能性。用LipofectamineTM2000將pDS－shCREG干擾載體轉染R1細胞，37℃ 培養24 h，去掉轉染試劑后繼續培養72 h，加入G418進行抗性篩選，G418篩選最適濃度為400 mg/L，挑取篩選獲得穩定表達的細胞克隆R1－shCREG。以正常組R1和陰性對照質粒GFP轉染的R1細胞(R1－GFP)為對照組進行下列實驗。

2.3 EBs制備 ESCs培養至亞融合狀態，用0.25%胰酶及0.53 mmol/L EDTA消化后，接種到明膠包被的培養皿中實施選擇性篩選，3 h后大部分STO細胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細菌培養皿中，培養液除無LIF外與ESCs培養液相同。連續培養3 d，中間不換液。第4 d，棄去7.5 mL原培養液，加入7.5 mL新鮮的EB細胞培養液。以后每天換液。

2.4 AKP染色 配制bufferⅢ緩沖液，其配方為:100 mmol/L Tris·HCl(pH 9.5)，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，將 BCIP/NBT 和 bufferⅢ按1∶100比例配制工作液。將3組ESCs接種到35 mm預先鋪有處理好的STO的組織培養皿中培養，2 d后棄掉培養液，PBS洗3遍。1%多聚甲醛4℃ 固定20 min，PBS洗3遍。加入1 mL配好的工作液，置于37℃孵育20 min后，取出于相差顯微鏡下觀察染色效果，當出現紫色時，以PBS終止顯色反應。

2.5 小鼠荷瘤實驗 胰酶消化ESCs，注射入小鼠心肌，細胞數量為(1－4)×106，注射3周后將小鼠處死，取出心臟，4%多聚甲醛4℃ 固定20 min，PBS洗3遍。冰凍切片HE染色觀察成瘤情況。

2.6 RT－PCR Trizol一步法提取細胞總 RNA，各取 1 μg RNA 按 TaKaRa RNA PCR kit說明書，以GAPDH為內參照，行cDNA合成及PCR擴增，引物序列如下:CREG上游引物為5'－GGGGGCCCAGTGTCACCAGGAAC－3'，下游引物為 5'－CGGGGGAGGCCATGACGGGAGTG－3';GAPDH上游引物為5'－ATCTGGCACCACACCTTCTACAAT －3'，下游引物為5'－CCGTCACCGGAGTCCATCA－3';caspase－3上游引物為 5'－CAGTGGGCTCACTCTGAAGACC－3'，下游引物為 5'－ ACGCGTTACTGGCATTGAGG－3';GAPDH上游引物為5'－TATTGGGCGCCTGGTCACCA －3'，下游引物為 5'－CCACCTTCTTGATGTCATCA－3'。CREG擴增條件如下:25℃ 50 min，95℃ 10 min，95 ℃ 45 s，42 ℃ 30 s，48 ℃ 1 min，進行45個循環，最后48℃ 2 min，得到CREG產物片段長度為 670 bp，GAPDH產物片段長度為 750 bp;caspase－3的擴增條件如下:50℃ 1 h，96℃ 5 min，96℃ 30 s，65 ℃ 30 s，69 ℃ 1 min，進行35個循環，最后69℃ 2 min，得到caspase－3產物片段長度為560 bp，GAPDH產物片段長度為650 bp。

2.7 Western blotting分析 按文獻[12]將全細胞提取物進行SDS－PAGE、轉膜、抗體結合及顯色。分離膠濃度為 12%;I抗分別為抗cleaved caspase－3和CREG抗體。經辣根過氧化物酶標記的II抗孵育后，按ECL試劑盒說明書曝光處理。

2.8 Annexin V/PI雙染色檢測細胞凋亡 胰酶消化，收集細胞。按照Annexin V－FITC凋亡檢測試劑盒說明書操作。以1×binding buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V－FITC及5 μL PI。室溫避光孵育15 min后，經260目濾網過濾，行流式細胞儀檢測[13]。

3 統計學處理

結 果

1 獲得穩定轉染CREG基因沉默R1細胞株(R1－shCREG)

倒置顯微鏡下觀察顯示，R1和R1－GFP均形成致密的細胞克隆，細胞克隆邊緣銳利清楚，以長橢圓形或圓形為主，細胞體積小;而R1－shCREG細胞生長速度相對較慢，以長橢圓形為主，R1－shCREG細胞邊緣與滋養層細胞分界相對模糊，細胞培養基中代謝廢物明顯增多，見圖 1A。R1－GFP、R1－shCREG和R1細胞的AKP染色發現，3組ESCs染色均為紫色，無明顯分化現象，提示CREG基因沉默不影響ESCs的“干性”，見圖1B。

2 R1－shCREG組來源的EBs中CREG表達受到明顯抑制

RT－PCR結果表明R1－shCREG/EB組的mRNA表達量明顯下降，與其它2組比較有顯著差異，見圖2A。Western blotting結果顯示，R1－shCREG/EB組 CREG的蛋白表達量較 R1/EB組和 R1－GFP/EB組分別下降了(78.0±1.3)%和(84.0±2.4)% ，P＜0.05。而R1－GFP/EB組與正常R1/EB組相比無顯著差異(P＞0.05)，見圖2B。

3 CREG基因沉默抑制ESCs分化

EBs分化實驗顯示，CREG基因沉默組ESCs來源的EBs在體外培養過程中不能自發分化成三胚層結構，見圖3A。同時，小鼠心肌荷瘤實驗顯示，注射R1－shCREG組小鼠心肌內不能形成畸胎瘤結構，見圖3B。

4 CREG基因沉默誘導ESCs來源的EBs凋亡

用Annexin V－FITC/PI雙染色行流式細胞術檢測ESCs分化7 d的 R1/EB、R1－GFP/EB及 R1－shCREG/EB的細胞凋亡率。結果顯示，R1－shCREG/EB組細胞凋亡率明顯高于R1/EB組(P＜0.05);而R1－GFP/EB組細胞的凋亡率與R1/EB組比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖4A。

RT－PCR和Western blotting檢測發現，與R1/EB組相比，ESCs分化7 d的R1－shCREG/EB細胞中caspase－3 mRNA和蛋白表達明顯增多(P＜0.05)，見圖4B、C。上述結果證實CREG基因沉默誘導ESCs來源的EBs自發性凋亡增多。

Figure 1.Establishment of stably－transfected R1 cells(R1－shCREG and R1－GFP)and verification of stemness of transfected ESCs(×200).A:R1 was transfected with GFP and pDS－shRNA－CREG under phase－contrast microscope;B:alkaline phosphatase(AKP)staining.R1－GFP:R1 transfected with GFP;R1－shCREG:R1 transfected with pDS－shRNA－ CREG.圖1 穩定轉染pDS－shRNA－CREG和GFP質粒細胞克隆株的建立及堿性磷酸酶染色鑒定ESCs細胞全能性

討 論

胚胎的穩定發育是指各個發育階段組織形態的穩定，凋亡是確保這一穩定的重要細胞學基礎。EB細胞自發性凋亡是三胚層結構發生及胚胎發育的重要過程之一。若細胞自發性凋亡異常增加，導致組織細胞構成失常，則無法維持胚胎的正常發育。我們前期研究證實，CREG是一種分泌型糖蛋白，可以與胰島素樣生長因子II競爭性結合細胞膜胰島素樣生長因子受體II，以自分泌和旁分泌2種方式誘導并維持組織或細胞分化;在胚胎發育早期E9.5 d，血管內皮細胞(endothelial cells，ECs)和血管平滑肌細胞分化始動過程中即伴有CREG表達，并持續整個胚胎血管發生過程。這一研究提示了CREG可能是血管發育過程中調控血管形成的重要因子。但本室前期研究也提示，降低成熟血管平滑肌細胞和骨髓間充質干細胞中CREG的表達，引起細胞大量的自發性凋亡發生。

因此，本研究應用逆轉錄病毒載體轉染，獲得穩定的CREG基因沉默的胚胎干細胞株(R1－shCREG)，從胚胎發育入手，利用我們已經建立的離體胚胎干細胞體外分化模型，研究CREG基因沉默對ESCs來源的EBs自發性凋亡的影響。結果發現，CREG基因沉默抑制了ESCs的分化，同時促進EBs自發性凋亡。中胚層的分化、結構穩定及成熟是胚胎發生的基礎，R1－shCREG/EB在發育過程中，細胞凋亡的控制介質caspase－3明顯增多，在多種凋亡信號刺激下經蛋白水解作用被激活成活化形式，可對多種蛋白底物進行降解，影響三胚層的發育，不能形成典型的三胚層結構使其結構異?；蛘叻只怀墒?，EBs發生受到影響，胚胎發育被抑制。本研究證實，下調CREG表達可以抑制ESCs分化，促進細胞凋亡的發生。但進一步的分子機制研究仍有待闡明。

Figure 2.The mRNA and protein expression of CREG in 3 kinds of EBs cultured for 7 d.A:the mRNA expression of CREG was assayed by RT－PCR;B:the protein expression of CREG was assayed by Western blotting.*P＜0.05 vs R1;#P＜0.05 vs R1－GFP.圖2 3組EBs培養7 d時檢測CREG mRNA和蛋白表達量

Figure 3.CREG gene silencing inhibited ESCs differentiation.A:differentiation of the 3 kinds of EBs on day 7 under phase－contrast microscope(×200);B:tumor formation assay inoculated in mouse myocardium.圖3 CREG基因沉默抑制ESCs分化

Figure 4.Apoptotic rate and the expression of caspase－3 mRNA and cleaved caspase－3 protein in 3 kinds of EBs on day 7.A:percentages of apoptotic cells were tested by Annexin V/PI dual－color flow cytometry;B:expression of caspase－3 mRNA in 3 kinds of ESCs were detected by RT－PCR;C:Western blotting was employed to test the protein expression of cleaved caspase－3.*P＜0.05 vs R1 or R1－GFP.圖4 EBs培養7 d細胞凋亡率檢測及caspase－3 mRNA和蛋白表達

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