siRNA干擾BMI－1基因對膀胱癌EJ細胞增殖的調控作用及其機制*

崔學江， 朱定軍， 韓金利， 梁 武， 蘇嘉銳， 謝文練

(中山大學孫逸仙紀念醫院泌尿外科，廣東廣州510120)

B細胞特異性莫洛尼鼠白血病病毒插入位點1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI－1)基因過度表達可與多種腫瘤細胞的形成及增殖形成有關[1]。研究表明在膀胱癌細胞中BMI－1亦有較高表達，但其促癌作用機制尚未完全明確。本課題組前期研究表明BMI-1基因在膀胱癌組織中的mRNA及蛋白表達，明顯高于癌旁組織，并且其表達量隨著腫瘤侵潤深度的增加和分化程度的降低而明顯升高，且與p16INK4a和p14ARF基因在膀胱癌組織及癌旁組織中的mRNA及蛋白表達量呈負相關[2]。本研究旨在進一步對膀胱癌EJ細胞株及膀胱正常移行上皮細胞中BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA及蛋白表達水平比較;同時構建siRNA干擾BMI－1基因，檢測其mRNA及蛋白表達的影響及對下游p16和p14基因mRNA及蛋白水平的調控作用及對細胞增殖的影響。

材料和方法

1 材料

膀胱癌EJ細胞株及膀胱正常移行上皮細胞株由本實驗室惠贈。DMEM培養基、F12K培養基、胎牛血清和無血清培養基Opti-MEM為Gibco產品;RNAiso和real-time RT-PCR試劑盒購于TaKaRa(大連寶生物工程有限公司);siRNA Oligo由上海吉瑪公司設計及合成;Lipofectine 2000購自Invitrogen;鼠抗人BMI-1單克隆抗體(05-637)購自Upstate;p16INK4a(sc-468)、p14ARF(sc-8340)購自 Stanta Cruz Biotechnology;β-actin購自Cell Signaling Technology;辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠、羊抗兔IgG購自Multiscience購自聯科生物公司;化學發光試劑盒、PVDF膜購自Millipore。

2 細胞培養和siRNA 轉染實驗分組

BMI－1基因(NM:005180)的siRNA 長度為21 nt，序列見表 1。EJ細胞于含 10%胎牛血清的DMEM培養基，膀胱正常移行上皮細胞用f-12k培養基，37℃、5%CO2條件下培養，0.125%胰酶消化傳代。5×108/L細胞種于6孔板，細胞80%融合時進行轉染實驗。脂質體轉染試劑Lipofectamine 2000用于siRNA轉染。

使用帶綠色熒光的非干擾BMI－1基因的小分子RNA(FAM-nag-siRNA)，6孔板培養細胞，每孔的細胞密度為6.0×105個，培養基2 mL;使用Lipo 5 μL/well，FAM-nag-siRNA共分以下4個濃度:50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L 和 150 nmol/L，得出轉染率最佳的siRNA濃度進行轉染。實驗分為5組:A:空白對照組;B:陰性干擾對照組;C:RNA干擾BMI－1基因12 h組;D:RNA干擾BMI－1基因24 h組;E:RNA干擾BMI－1基因48 h組。取轉染率最佳的轉染濃度轉染12 h、24 h、48 h后提取RNA和轉染24 h、48 h、72 h后提取蛋白質。

3 實時定量RT－PCR

Trizol兩步法提取膀胱正常移行上皮細胞和EJ細胞的總RNA，以mRNA為模板，oligo dT為引物，逆轉錄成 cDNA，逆轉錄反應條件為37℃ 15 min，85℃ 5 s。Real-time PCR反應條件為:預變性95℃ 30 s，1個循環;PCR反應95℃ 5 s，60℃ 20 s，40個循環;熔解曲線分析95℃ 1 s，65℃ 15 s，95℃ 0 s。LightCycler(Roche Diagnostics)實時定量PCR檢測干擾前后及對照組EJ細胞和膀胱正常移行上皮細胞中BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA的表達差異。引物序列見表1。

表1 實時定量RT－PCR及RNAi引物序列Table 1.Sequences of primers for real-time RT-PCR and RNAi

4 Western blotting檢測

BMI-1、p16INK4a和p14ARF在EJ細胞和膀胱正常移行上皮細胞的表達:按常規方法提取蛋白質并進行定量(Bradford法)。6孔板細胞覆蓋80%后以RIPA緩沖液0.8 mL，冰上裂解30 min，12 000×g離心30 min，取上清液并進行蛋白定量。組織及細胞裂解液每道上樣量25 μg，10%-15%十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳，低電壓轉膜過夜。PVDF膜于10%脫脂奶粉封閉4 h，加入抗BMI-1抗體(1∶750)、抗 p16INK4a抗體(1∶250)、抗 p14ARF抗體(1∶250)、抗β-actin抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次10 min，然后加入羊抗鼠及羊抗兔IgG 1∶7 500 1 h，化學發光后X光片曝光。

5 細胞免疫熒光

采用雙染法。I抗抗 BMI-1抗體(1∶50)，抗p16INK4a(1∶50)、抗 p14ARF(1∶50);熒光Ⅱ抗，CY3-羊抗小鼠 IgG(1∶75)，FITC-羊抗兔 IgG(1∶50)。核染料采用DAPI染核15 min。

6 生長曲線測定

細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)檢測轉染后細胞存活情況并繪制生長曲線。

7 統計學處理

結 果

1 細胞免疫熒光結果

BMI-1蛋白在膀胱癌EJ 細胞陽性反應為紅色熒光，主要表達于細胞核，部分胞漿亦有熒光染色;p16INK4a和p14ARF蛋白均表達于膀胱癌多種細胞株細胞，陽性呈綠色熒光，兩者在細胞核和細胞漿中均可見綠色熒光，細胞核呈藍光，見圖1。

Figure 1.Cellular immunofluorescence of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin T24 cells(A)，EJ cells(B)，5637 cells(C)and Tccsup cells(D).BMI-1 displays red.p16INK4a and p14ARFdisplay green(a2 is p16INK4a，b2 is p14ARF).Nuclear displays blue(×400).圖1 BMI－1、p16INK4a和p14ARF蛋白在 EJ細胞、T24細胞、5637細胞和Tccsup細胞中的表達

2 BMI－1、p16INK4a和 p14ARF在人膀胱移行上皮細胞及EJ細胞中的mRNA及蛋白表達水平

實時定量RT-PCR檢測mRNA水平，BMI-1 mRNA在EJ細胞中表達高于正常膀胱移行上皮細胞，而p16INK4a和p14ARFmRNA在EJ細胞中低表達，P＜0.05，差異顯著;Western blotting檢測蛋白表達水平，與mRNA表達基本一致，BMI-1蛋白在EJ細胞中表達較正常膀胱移行上皮細胞中高，p16INK4a和p14ARF蛋白表達在EJ細胞中表達低，見圖2。

Figure 2.The relative expression levels of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin hBTC and EJ cells.±s.n=4.*P＜0.05 vs hBTC.hBTC:human bladder transitional epithelium cells.圖2 BMI－1、p16INK4a和p14ARF在EJ細胞及人膀胱移行上皮細胞中mRNA和蛋白的相對表達量

3 不同siRNA濃度的轉染率

FAM-nag-siRNA分為以下4個濃度:50 nmol/L、75 nmol/L、100 nmol/L 和 150 nmol/L，測得轉染率分別為:(67.25±2.97)%、(81.66±0.64)%、(92.55±0.41)%和(91.56±1.39)%，即siRNA濃度為100 nmol/L時轉染效率最高，各組比較差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Transfection efficiencies of four concentrations of FAM-nag-siRNA(×100).A:50 nmol/L(67.25% ±2.97%);B:75 nmol/L(81.66%±0.64%);C:100 nmol/L(92.55%±0.41%);D:150 nmol/L(91.56%±1.39%);E:transfected EJ cells in white light;F:transfected EJ cells in green light.圖3 4種濃度FAM－nag－siRNA的轉染率

4 轉染后EJ細胞目的基因表達情況

實時定量 RT-PCR檢測 BMI-1、p16INK4a和p14ARFmRNA的相對表達量，結果發現，siRNA(100 nmol/L)干擾BMI-1后其mRNA相對表達量在24 h和48 h與空白組相比顯著下降(P＜0.05)，而p16INK4a和p14ARFmRNA相對表達量在干擾后12 h、24 h和48 h均比空白組顯著上升(P＜0.05)，見圖4。

Western blotting檢測蛋白相對表達情況發現，siRNA干擾BMI－1后，BMI-1蛋白表達量下降，并且在72 h時下降最明顯;p16INK4a和p14ARF蛋白量上升，分別于48 h和72 h上升最明顯，見圖5。

5 CCK－8分析轉染后EJ細胞活力及生長的變化

干擾后的EJ細胞與空白對照組、陰性對照組相比，12 h、24 h EJ細胞存活數無明顯變化。48 h開始siRNA干擾組(0.450±0.198)、空白對照組(0.810±0.089)和陰性對照組(0.790±0.099)之間的差異顯著(P＜0.05)。干擾BMI－1后EJ細胞在72 h處于生長平臺期，生長速度變緩，見圖6。

6 EJ細胞的凋亡情況

各組EJ細胞的凋亡率為:空白對照組(5.85±0.31)%，陰性對照組(6.52±0.46)%，干擾48 h后(12.74±0.76)%，干擾72 h后(16.34±0.77)%。空白對照組與陰性對照組比差異不顯著(P＞0.05);空白對照組分別與干擾48 h、72 h比，差異均顯著(P＜0.01)，干擾48 h與72 h比差異顯著(P＜0.01)，見圖7。

Figure 4.The mRNA expression of BMI-1，p16INK4aand p14ARF in EJ cells with different treatments.A:BMI-1;B:p16INK4aand p14ARF.NC:normal control;NEG:negative control;12 h:RNAi for 12 h;24 h:RNAi for 24 h;48 h:RNAi for 48 h.±s.n=4.圖4 siRNA干擾BMI－1后不同時點 BMI－1、p16INK4a和p14ARFmRNA的表達

Figure 5.The protein levels of BMI-1，p16INK4aand p14ARFin EJ cells with different treatments.±s.n=5.*P＜0.05 vs NC.圖5 siRNA干擾BMI－1后不同時點BMI－1、p16INK4a和p14ARF蛋白的表達

Figure 6.Growth curves of EJ cells with different treatments.圖6 空白對照組、陰性對照組和RNA干擾BMI－1組的EJ細胞生長曲線

討 論

BMI－1基因被認為是一種癌基因，其可與cmyc癌基因協同作用引起細胞轉化和腫瘤形成。[1，3]。p16INK4a和 p14ARF是重要的抑癌基因，其功能的失活在多種腫瘤的發生中起重要作用[4，5]。但是在腫瘤細胞株及正常的膀胱移行上皮細胞中的比較仍少見報道，并且BMI-1與p16INK4a、p14ARF的調控機制仍未明確。本文通過對其表達及siRNA干擾BMI－1基因后上述基因的表達及蛋白表達的變化進一步明確其調控機制。

Figure 7.The apoptosis of EJ cells detected by flow cytometry.A:normal control(5.85%±0.31%);B:negative control(6.52%±0.46%);C:RNAi for 48 h(12.74%±0.76%);D:RNAi for 72 h(16.34%±0.77%).± s.n=20.*P ＜0.05 vs A.圖7 siRNA干擾48 h和72 h后EJ細胞凋亡情況

本研究結果表明:BMI-1 mRNA及蛋白水平在膀胱癌EJ細胞株中的表達比膀胱正常移行上皮細胞的表達水平明顯高。對于BMI-1的表達，有研究表明在多種腫瘤細胞中都有高表達，其對造血干細胞、白血病細胞的自我更新起重大作用，在乳腺癌、肝癌、胃癌、大腸癌、肺癌、神經母細胞瘤、黑色素瘤等腫瘤，以及膀胱癌組織、膀胱癌T24細胞株、5637細胞株中均發現較高表達[6-8]。BMI－1基因作為轉錄抑制因子，對腫瘤細胞的周期調節起抑制作用，影響細胞的增殖及凋亡[8]。膀胱癌EJ細胞株屬于惡性度較高的細胞株，目前較少研究BMI-1在其中的表達及調控機制。本研究結果提示在EJ細胞中，BMI-1的高表達，說明膀胱癌EJ細胞中BMI-1為其促癌的一個可能的重要靶點。

對于BMI-1的調控機制，Park等[8]研究表明BMI-1可抑制p16INK4a和p14ARF的表達，導致癌基因過度激活和抑癌基因失活而調節細胞的增殖與凋亡，Liu等[9]研究表明BMI-1與多種蛋白如c-Myc等對cyclin D2進行調節。但亦有研究表明BMI-1調控下游基因存在PI3K/Akt通路[9]及調節端粒酶的活性影響細胞增殖[10]，陳鳳花等[11]研究真核表達載體pEGFP-BMI-1轉染宮頸癌細胞系HeLa，顯著下調 p16INK4a、HOXA9和 HOXC13的表達，而hTERT和HOXB4無明顯影響。在膀胱癌EJ細胞中，仍未有明確的研究表明BMI-1的調控機制。

本研究結果顯示p16INK4a和p14ARF在EJ細胞中的表達較膀胱正常移行上皮細胞低。以往較多研究使用反義寡核苷酸及shRNA、mircoRNA等抑制BMI－1基因，可以起到抑制作用[12]。本研究使用siRNA干擾BMI－1基因后，BMI-1 mRNA及蛋白水平都有下降，提示使用脂質體轉染siRNA可以有效沉默BMI－1基因。沉默后p16INK4a和p14ARF升高，說明兩者有相關性，在調節通路上，p16與p14具有某些共同的調節位點。沉默BMI－1后EJ細胞的凋亡增多，提示在EJ細胞中，BMI-1調節細胞增殖的機制主要為調節其下游p16INK4a和p14ARF，并且通過抑制p16INK4a和p14ARF的表達來調節細胞生長。目前研究表明，p16INK4a與調節 cyclin D/CDK4/6有關，而p14ARF與抑制MDM2作用減弱有關，兩者都有共同通路就是使E2F轉錄蛋白增多，細胞增殖增強[13]。

Silva等[14]在乳腺癌中的研究表明 BMI-1對INK4a/ARF的轉錄抑制是通過其多梳基因家族(PcG)的Mel18和Hpc2蛋白形成多梳組多蛋白抑制復合物1(PRC1)，協同作用抑制。Dhawan等[15]在對胰島β細胞的研究中表明，BMI-1與PcG家族中的Ezh2蛋白構成PRC1的重要組成部分;Ezh2蛋白導致H3K27三甲基化，增加BMI-1與H2組蛋白、INK4a/ARF位點的結合力，導致H2組蛋白泛素化，抑制INK4a/ARF轉錄。

綜上所述，本研究進一步證實在膀胱癌細胞EJ細胞中，BMI－1是一個重要的癌基因位點，其與cmyc協同作用，調節腫瘤細胞的增殖，可以作為一個檢測及治療的新靶點。同時，使用siRNA干擾技術可以有效沉默BMI－1基因;在膀胱癌EJ細胞中存在p16INK4a/p14ARF調控通路，沉默BMI－1可以通過該通路影響細胞生長周期及凋亡。

[1]van Lohuizen M，Verbeek S，Scheijen B，et al.Identification of cooperating oncogenes in Eμ-myc transgenic mice by provirus tagging[J].Cell，1991，65(5):737-752.

[2]劉宏偉，謝文練，韓金利，等.Bmi-1在膀胱移行細胞癌組織的表達及與p16INK4a和p14ARF的關系[J].中華實驗外科雜志，2010，27(10):1542-1543.

[3]Reinisch C，Kandutsch S，Uthman A，et al.BMI-1:a protein expressed in stem cells，specialized cells and tumors of the gastrointestinal tract[J].Histol Histopathol，2006，21(11):1143-1149.

[4]張 軍，張 旭，許 凱，等.膀胱移行細胞癌患者血清p14基因異常甲基化檢測的意義[J].中華實驗外科雜志，2007，24(3):333-335.

[5]楊志偉，鄭新民，胡禮泉，等.原發性膀胱移行細胞癌p16基因缺失突變的研究[J].中華實驗外科雜志，2001，18(1):8-9.

[6]林妙霞，文卓夫，馮智英，等.大腸癌中Bmi-1的表達及其臨床病理意義[J].中國病理生理雜志，2009，25(3):497-501.

[7]呂 進，曹秀峰，紀 律，等.β-catenin、Wnt1、Smad4、Hoxa9、Bmi-1與食管鱗癌預后的關系[J].世界華人消化雜志，2010，18(27):2874-2883.

[8]Park IK，Morrison SJ，Clarke MF.Bmi1，stem cells，and senescence regulation[J].J Clin Invest，2004，113(2):175-179.

[9]Liu Y，Yang Y，Xu H，et al.Implication of USP22 in the regulation of BMI-1，c-Myc，p16INK4a，p14ARF，and cyclin D2 expression in primary colorectal carcinomas[J].Diagn Mol Pathol，2010，19(4):194-200.

[10]Qin ZK，Yang JA，Ye YL，et al.Expression of Bmi-1 is a prognostic marker in bladder cancer[J].BMC Cancer，2009，9:61.

[11]陳鳳花，李一榮，王 琳，等.過表達BMI-1對HeLa細胞中HOX基因表達和細胞周期的影響[J].中國病理生理雜志，2009，25(12):2366-2370.

[12]廖百花，馮亦軍，曾祿賢，等.固相轉染HPV16-siRNA對荷宮頸癌細胞SiHa小鼠瘤體體積及P53、P16表達的影響[J].中國病理生理雜志，2011，27(3):509-513.

[13]Breuer RH，Snijders PJ，Sutedja GT，et al.Expression of the p16INK4agene product，methylation of the p16INK4apromoter region and expression of the polycomb-group gene BMI-1 in squamous cell lung carcinoma and premalignant endo-bronchial lesions[J].Lung Cancer，2005，48(3):299-306.

[14]Silva J，García JM，Pe?a C，et al.Implication of polycomb members Bmi-1，Mel-18，and Hpc-2 in the regulation of p16INK4a，p14ARF，h-TERT，and c-Myc expression in primary breast carcinomas[J].Clin Cancer Res，2006，12(23):6929-6936.

[15]Dhawan S，Tschen SI，Bhushan A.Bmi-1 regulates the Ink4a/Arf locus to control pancreatic β-cell proliferation[J].Genes Dev，2009，23(8):906-911.