基于聚硫堇/納米金固定酶的過氧化氫生物傳感器

黃小梅，鄧 祥，吳 狄

(四川文理學院化學與化學工程系，四川 達州 635000)

過氧化氫(H2O2)是許多生化反應的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物，與許多生物過程有關，而且又是工業(yè)、生物、環(huán)境、臨床診斷和食品檢測分析中的重要組份，因此對H2O2含量的測定具有非常重要的意義.目前，對其進行定性或定量檢測的常用方法有化學發(fā)光法［1］、熒光法［2］和電化學法［3－4］等方法.其中電化學方法，特別是酶電化學生物傳感器，由于其方法簡單、靈敏度高、專一性強等特點而被廣泛應用于H2O2的測定.然而在酶電化學傳感器的研制中，由于酶本身易失活且酶分子量大，酶的活性中心深埋在多肽結(jié)構(gòu)內(nèi)部，很難發(fā)生直接電子傳遞，因此如何有效地利用生物分子固定技術及固定材料來保持酶的活性、提高酶的固載量以及加速電子傳遞速率是制備性能優(yōu)良的酶電化學傳感器的關鍵問題.近年來的研究表明，電子媒介體以及納米金屬材料的引入能顯著加速電子傳輸速率、增大生物分子的固載量以及提高傳感器的靈敏度［5－7］.

本實驗首先在玻碳電極表面電聚合一層電子媒介體硫堇(PTH)，再利用其表面的－NH2，通過靜電作用和共價結(jié)合，吸附帶負電的納米金，從而形成具有比表面積大、吸附力強、生物相容好等優(yōu)點的納米金層［8－9］，最后利用納米金吸附帶正電荷的過氧化物酶(HRP)，從而制得HRP/nano－Au/PTH/GC傳感器.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器:CHI660C電化學工作站(上海辰華儀器公司);BRANSONIC200超聲清洗儀(德國BRANSONICULTRASCHALL公司);FA1004N電子天平(上海菁海儀器公司);pHS－4C型酸度計(成都方舟科技開發(fā)公司).

試劑:硫堇(Thi，上海化學試劑公司);氯金酸(HAuCl4，Sigma公司);過氧化氫酶(HRP，Sigma公司);H2O2(濃度30%，分析純)，精確濃度經(jīng)高錳酸鉀標準溶液滴定，0.1 molL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，Na2HPO4－KH2PO4配制;其余試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 納米金的制備

金溶膠的制備參見文獻［10］:取100 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的氯金酸，在劇烈攪拌下加熱至沸騰后，迅速加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的檸檬酸鈉，繼續(xù)攪拌，微沸15 min即可.所得金溶膠呈亮紅色，于棕色瓶中4℃條件下保存.

1.3 傳感器的制備

首先將玻碳電極(GC)依次用0.3 μm、0.05 μm的Al2O3粉末拋光成鏡面，并依次用丙酮、NaOH 溶液(10%)、HNO3(1∶1)、二次蒸餾水超聲清洗各5 min.將處理好的電極放入含0.05 molL硫堇(Thi)、0.1 molL的磷酸緩沖溶液(PBS，pH 6.0)中，先在1.5 V 下電沉積 10 min，再在－0.40 ～0.12 V(vs.SCE)的電位范圍內(nèi)，以50 mVs的速度循環(huán)掃描20圈后取出，在室溫下放置晾干即得PTH/GCE電極［11］.硫堇薄膜的沉積過程如圖1所示.然后將電極侵入1.0 mL的納米金溶膠中6 h，最后將該電極置于10 mgmL HRP溶液中在4℃條件下浸泡過夜，即制得HRP/nano－Au/PTH/GCE傳感器.

圖1 玻碳電極上電沉積硫堇薄膜過程圖

1.4 檢測方法

采用三電極檢測裝置:飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對比電極，修飾電極為工作電極，在優(yōu)化的實驗條件下，于0.1 molL PBS(pH=6.0)緩沖溶液中，進行循環(huán)伏安和計時電流測試，記錄該傳感器對H2O2的安培響應.

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的電化學表征

采用循環(huán)伏安法(CV)對電極的修飾過程進行表征，圖2是電極在電位區(qū)間為 －0.4～0.0 V，0.1molLPBS(pH=6.0)的緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖.由圖2可知，當裸玻碳電極(a)修飾上PTH后，可觀察到一對Thi的氧化還原峰(b)，說明Thi成功聚合于電極表面，形成良好的導電膜，并能發(fā)生較好的可逆反應.當納米金修飾到PTH/GC表面后，電極的氧化還原峰電流進一步增大(c)，這是因為納米金有良好的導電性，同時也能很好地傳遞電子.最后當HRP被吸附到納米金上，氧化還原峰電流明顯降低(d)，這是由于HRP是生物大分子，阻礙了電子的傳遞.

圖2 不同修飾電極的循環(huán)伏安表征圖

2.2 傳感器的電化學特性

圖3是該生物傳感器對H2O2的循環(huán)伏安響應.由圖3可見，當向空白底液中加入0.7 mmolL H2O2時，還原電流明顯增加，氧化電流略微降低(如圖3曲線b)，顯示出明顯的電催化特征.然而，沒有HRP存在的修飾電極對H2O2幾乎沒有電化學響應.這就說明對H2O2有明顯電催化還原作用的是固定在修飾電極上的HRP，而Thi只是該反應體系的有效電子轉(zhuǎn)移介體.該生物傳感器的反應機理如下［12］:

H2O2+HRP(Red)→HRP(Ox)+H2O2，

HRP(Ox)+Thi(Red)→HRP(Red)+Thi(Ox)，

Thi(Ox)+H++2e→Thi(Red).

其中HRP(Red)和 HRP(Ox)分別表示 HRP的還原態(tài)和氧化態(tài);Thi(Red)和Thi(Ox)分別表示硫堇的還原態(tài)和氧化態(tài).

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為獲得性能優(yōu)良的生物傳感器，我們對pH值和工作電位進行了優(yōu)化.pH值不僅會影響生物酶的催化活性和穩(wěn)定性，而且也會影響硫堇的電化學行為.因此對pH值的優(yōu)化顯得尤為重要.當pH值為6.0時，該生物傳感器對H2O2的響應出現(xiàn)最大值.因此，我們選用pH值為6.0的PBS作為支持電解質(zhì).

生物傳感器工作電位確定在－0.5～0.0 V之間進行.實驗表明，隨著工作電位的負向增大，響應電流逐漸增大，但考慮到在過高的負電位下，溶液中共存的其它電活性物質(zhì)也越容易在電極上直接被還原而產(chǎn)生干擾，且硫堇的還原峰電位也在－0.25 V左右，所以本實驗選擇－0.25 V作為工作電位.

圖3 傳感器對H2 O2響應的循環(huán)伏安圖

2.4 傳感器的計時電流響應

在優(yōu)化后的最佳實驗條件下，該傳感器對不同濃度H2O2的計時電流曲線如圖4所示.從圖4中可看出，隨著H2O2濃度的增大，響應電流也不斷增大，響應電流與H2O2濃度在1.4×10－6～4.26 ×10－3molL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系.線性回歸方程為:Ip(μA)=0.9818［H2O2］(mmolL)– 1.6901，相關系數(shù) R=0.9993(n=23)，檢測下線為4.0 ×10－7molL(SN=3).該傳感器對H2O2響應迅速，在5 s內(nèi)可達到穩(wěn)態(tài)電流的95%，這是由于實驗采用層層自組裝技術組裝的膜層厚度相當薄，有利于電子的傳輸.另外是因為酶的氧化還原中心被深埋在酶蛋白分子里面，它與電極表面直接的電子傳遞進行困難，電子傳遞速率緩慢，而硫堇的引入則為酶的活性中心和電極之間的電子傳遞架起了橋梁，起到了加速電子傳遞的作用，因而大大地縮短了響應時間.

圖4 傳感器對H2 O2的計時電流響應曲線

2.5 干擾實驗

在含3.5 ×10－4molL H2O2的 PBS 中，分別加入7.0 ×10－4molL的6種干擾物質(zhì)，測定其對傳感器響應信號的干擾結(jié)果如表1所示.實驗結(jié)果表明，這些物質(zhì)對傳感器的測定干擾電流信號均在±3%之內(nèi)，沒有明顯的干擾.這主要歸因于我們選擇了較低的工作電位(－0.25 V)來檢測H2O2.

表1 干擾實驗的測定

2.6 傳感器的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性

該生物傳感器對濃度為3.5×10－4molL的H2O2平行測定10次，所得相對標準偏差為4.6%，說明該生物傳感器具有較好的重現(xiàn)性.

3 結(jié)語

本實驗以電聚合、靜電吸附和共價結(jié)合制得一種過氧化氫傳感器.該傳感器以硫堇作為過氧化物酶催化還原過氧化氫中的電子媒介體，加速催化還原過程中的電子傳遞，減少了催化還原過程中的其它氧化物的干擾，且提高了傳感器的靈敏度和響應速率.

［1］Hanaoka S，Lin JM，Yamada M.Chemiluminescent flow sensor for H2O2based on the decomposition of H2O2catalyzed by cobalt(II)－ethanolamine complex immobilized on resin［J］.Anal.Chim.Acta，2001，426:57－64.

［2］Czochra M P，Wideňska A.Spectrofluorimetric determination of hydrogen peroxide scavenging activity［J］.A-nal.Chim.Acta，2002，452(2):177－184.

［3］Wang L，Wang E K.A novel hydrogen peroxide sensor based on horseradish peroxidase immobilized on colloidal Au modified ITO electrode［J］.Electrochem.Commun，2004，6:225 －229.

［4］Zhao G，Xu J J，Chen H Y.Fabrication characterization of Fe3O4multilayer film and its application in promoting direct electron transfer of hemoglobin［J］.Electrochem.Commun，2006，8:148－154.

［5］Mehmet S，Emre C，Abasiyanik M F.Amperometric hydrogen peroxide biosensor based on covalent immobilization of horseradish peroxidase on ferrocene containing polymeric mediator［J］.Sensors and Actuators B.2010，145:444－450.

［6］Wu SA，LiQ F，Hui Y M，etal.Amperometric H2O2biosensor based on poly－thionine nanowire/HRP/nano－Au － modified glassy carbon electrode［J］.Sensors and Actuators B，2008，129:779 －783.

［7］Meral T S，Gokdogan O Z，Ahmet G，et al.Amperometric glucose biosensor based on gold－deposited polyvinylferrocene film on Pt electrode［J］.Biosensors and Bioelectronics，2006，21:1719 －1726.

［8］Daniel M C，Astruc D.Gold Nanoparticles:assembly，supramolecular chemistry，quantum－size－related properties，and applications toward biology，catalysis，and nanotechnology［J］.Chem.Rev，2004，104:293 －346.

［9］趙紅秋，林琳，唐季安，等.利用納米金顆粒增強DNA探針在傳感器上的固定程度和識別能力［J］.科學通報，2001，46(4):5－7.

［10］Frens G.Controlled nucleation for the regulatio of the particle size in monodisperse gold suspensions［J］.Nature Physci，1993，241:20 －22.

［11］安海珍，袁若，柴雅琴，等.基于聚硫堇、DNA/納米銀復合物共修飾癌胚抗原免疫傳感器的研究［J］.化學學報，2008，66(6):633 －638.

［12］Durliat H，Courteix A，ComtatM.Reactions of horseradish peroxidase on a Platinum cathode［J］.Bioelectrochem Bioenerg，1989，22(3):197 －209.