非小細胞肺癌中EML4-ALK融合及臨床治療進展

吳荻 于鴻

肺癌的死亡率居惡性腫瘤的首位。其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占80%，被確診時多為晚期。傳統的化療能改善近期療效，對生存期的改善有限，故中位生存時間為12個月左右，預后差[1]。近年來，分子靶向藥物治療正在成為肺癌治療的熱點，如10%-30%的NSCLC患者攜帶活化的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變，70%以上的EGFR突變患者對小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）高度敏感，有明顯的生存獲益。因此，發現和確認肺癌患者的分子亞型，尋找有效的分子靶向治療靶點是當前需要迫切解決的問題[2]。

1 EML4-ALK的發現及其結構特點

最近發現一種新的癌基因，棘皮動物微管相關蛋白樣4-間變性淋巴瘤激酶（echinoderm microtubuleassociated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK）參與了NSCLC的發生過程。EML4是棘皮動物微管相關蛋白樣蛋白質家族成員[3]，其結構組成包含一個N-端基本區，一個疏水的棘皮動物微管相關蛋白樣蛋白（hydrophobic echinoderm microtubule-associated protein-like protein, HELP）域和WD重復區。ALK首先在間變性大細胞淋巴瘤中被發現，作為一個核磷蛋白（nucleophosmin,NMP）的融合者，伴隨一個t（2; 5）染色體重排[4]。EML4和ALK都位于2號染色體短臂上（2p21和2p23，間隔12個堿基），方向相反，通過染色體片段倒位產生了EML4-ALK融合基因。

2007年，Soda等[5]首次報道從1例62歲吸煙的肺腺癌患者腫瘤組織中擴增出由3,926 bp組成的DNA片段，編碼1,059個氨基酸組成的蛋白質。蛋白質的氨基端部分（殘基1-496）被鑒定為人EML4基因的一部分，而羧基端部分（殘基497-1,059）是人ALK基因的胞內域，表明該cDNA是EML4和ALK的融合產物。隨后的研究[6]發現，EML4-ALK融合基因有多個亞型，所有的亞型都含有ALK胞內酪氨酸激酶結構域，始于編碼外顯子20的位置；EML4在融合基因中以可變的截斷的形式存在，其WD重復區的數目在各亞型中不同。

涉及到ALK位點的其它染色體易位，如NPM-ALK已在淋巴瘤和炎性肌纖維母細胞瘤等腫瘤中被發現[7]。ALK的融合點在大多數這種嵌合的酪氨酸激酶中是保守的，包括EML4-ALK。這些融合蛋白的氨基端部分負責蛋白的寡聚化，導致組成性激活ALK激酶和異常活化下游信號，包括Akt、STAT3和細胞外信號調節激酶1/2等。正是這種細胞信號轉導通路的異常活化，賦予了此類腫瘤細胞生長、增殖、抗凋亡等表型的改變，從而改變其生物學行為。

2 EML4-ALK亞型的鑒定

Soda等[5]發現EML4外顯子13下游的內含子13在大約3.6 kb處中斷，反轉連接到ALK外顯子21上游297 bp處，產生了EML4-ALK的亞型1。將表達EML4-ALK的質粒導入到小鼠3T3成纖維細胞中，證明EML4-ALK具有惡性轉化活性。他們檢測了33例NSCLC標本中EML4-ALK的融合頻率，發現3例（9.1%）存在EML4-ALK亞型1；6例（18.2%）存在EGFR外顯子19的缺失或替換，但是均沒有EML4-ALK融合基因；KRAS突變患者也沒有EML4-ALK融合。他們又在一組42例NSCLC患者中篩選EML4-ALK融合，結果發現在2例肺腺癌患者中存在其它EML4-ALK亞型，EML4在外顯子20下游545 bp位置被中斷，并融合到ALK的外顯子21上游232 bp處（亞型2）。

2008年有研究[8]在2例NSCLC患者中發現并鑒定了EML-ALK亞型3a和3b。EML4-ALK亞型3a和3b都顯示出不低于亞型1和2的轉化活性和激酶活性。進一步研究EML4-ALK激活的細胞內信號通路，用熒光素酶報告基因連接Fos、Myc、Bcl-XL、NF-κB和GAS（STAT-1和STAT3的靶點）基因的啟動子，然后將連接產物和一個表達EML4-ALK亞型3的質粒共同導入到HEK293細胞中，結果表明EML4-ALK亞型3b激活Fos和Myc基因的啟動子；相反，雖然STAT3已被證明是一個NPM-ALK融合蛋白的下游目標，EML4-ALK卻沒有激活GAS，表明STAT3不太可能是EML4-ALK的主要靶標。EML4-ALK沒有激活Bcl-XL基因的啟動子，誘導一個弱的但是明顯增強的NF-κB結合序列的激活[3]。

為了更靈敏地檢測EML4-ALK融合，Takeuchi 等[9]建立了一個多重逆轉錄PCR系統捕獲兩個基因間所有可能的融合，又確認了2個新的融合亞型，其中EML4外顯子14（亞型4，帶有額外的11個核苷酸，來源不明，反轉連接到ALK的外顯子20的第50位核苷酸）或外顯子2（亞型5a和5b，5b的EML4的外顯子2連接到ALK的外顯子20，并插入了來自19內含子的117 bp）連接到ALK外顯子20。EML4-ALK的新形式表現出明顯的致癌活性。

與此同時，Koivunen等[10]篩選了305例NSCLC標本和83個NSCLC細胞系。首次確定了在白種人NSCLC患者和NSCLC細胞系中EML4-ALK的融合頻率。305例中有8例（3%）存在EML4-ALK融合基因，其中2例為新亞型（亞型4），是EML4的外顯子15與ALK的外顯子20融合的產物。在167例韓國患者中有6例攜帶EML4-ALK融合基因（3.6%），138例美國患者中有2例（1.5%）攜帶EML4-ALK融合基因。這8例患者均沒有KRAS和BRAF突變，但有1例患者有EGFR突變。所有攜帶EML4-ALK的腫瘤和細胞系都是腺癌。EML4-ALK在NSCLC患者中更頻繁，在女性中（4%）比在男性（2%）中更高。不吸煙或輕度吸煙者高于吸煙患者（6% vs 1%, P=0.049）。另外，在83個NSCLC細胞系中發現有3個細胞系（3.6%）中存在EML4-ALK融合基因。其中H3122表達EML4-ALK的亞型1；H2228表達亞型3a和3b。

Takeuchi等[11]為了檢測ALK融合，建立了一種插入式抗體強化聚合物（intercalated antibody-enhanced polymer,iAEP）方法，在主要的ALK抗體和葡聚糖聚合物檢測試劑之間合并一個插入抗體，敏感性較高。在免疫組化介導的EML4-ALK檢測中，使用iAEP，除了在所有的NSCLC樣本中發現了已知的EML4-ALK陽性腫瘤外，又發現了新的EML4-ALK亞型（亞型6，EML4的外顯子13融合到ALK的外顯子20的上游的69 bp的位置；亞型7，EML4的外顯子14融合到ALK的外顯子20的核苷酸13）和一個新的ALK融合基因KIF5B-ALK。

目前在NSCLC及包括乳腺癌和大腸癌在內的其它腫瘤中已發現并確認了11種以上的EML4-ALK亞型（圖1）[12]，發生不同位點融合的原因及物質基礎尚不明了，因此其發生機制引起廣泛的關注。它們的轉化活性和激酶活性也存在差異，這種差異在腫瘤發生過程中起到什么作用需要進一步研究闡釋。不同亞型對ALK抑制劑的應答可能也會不同，值得我們在體內外研究中深入探討。

3 亞裔人群EML4-ALK基因融合特點及臨床特征

2009年Wong等[13]報道了中國NSCLC患者EML4-ALK的融合頻率、基因表達譜和臨床病理特征。在266例手術切除的原發NSCLC標本（包括腺癌、淋巴上皮樣癌、鱗狀細胞癌、粘液表皮樣癌、腺鱗癌）和24個肺癌細胞系中（包括18個NSCLC細胞系、1個小細胞癌細胞系和5個自行建立的NSCLC細胞系[14]）研究了EML4-ALK的表達情況。結果表明，這些NSCLC標本中有13例（4.9%）表達EML4-ALK，其中8例表達亞型3（3a和3b）；2例表達亞型1；2例表達亞型2，還有1例標本表達新的EML4-ALK亞型（亞型5，涉及EML4的外顯子18）。EML4-ALK表達與不吸煙有關（P=0.009）。含融合基因的腫瘤EGFR和KRAS基因呈野生型。EML4-ALK陽性的腺癌患者平均年齡更低（P=0.018）。24個細胞系都不表達EML4-ALK。與以前的報道不一致，該項研究沒有觀察到攜帶融合基因的患者在性別、腫瘤病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤大小或病理發展階段之間存在明顯的相關性。其原因可能與觀察病例之間的差異、NSCLC亞型和相對小的樣本量有關。

圖1 EML4-ALK融合基因結構示意圖。EML4-ALK融合發生在ALK外顯子20附近，在結構上能與之融合的EML4的相應的外顯子的位置如箭頭所示。CC：coiled-coil域；HELP：疏水的EMAP (棘皮動物微管-相關蛋白) 樣蛋白域；WD：WD重復區；Kinase：ALK的酪氨酸激酶域。Fig 1 Structure of EML4-ALK fusion gene. The corresponding positions of exons(e) of EML4 can be fused in-frame to exon 20 of ALK are indicated by arrows. CC, coiled-coil domain; HELP, hydrophobic EMAP (echinoderm microtubule-associated protein) like protein domain; WD, WD repeats;Kinase, Tyrosine kinase domain of ALK.

2010年張緒超等[15]報道一組103例NSCLC患者中EML4-ALK融合基因的頻率，確定12例（11.6%）表達EML4-ALK。1例表達亞型5（E2; A20, 408 bp）；3例表達亞型9（E18; A20, 2,256 bp）；4例表達亞型1（E13;A20, 1,689 bp）；1例表達亞型2（E20; A20, 2,445 bp）；3例表達亞型3a/b（E6；A20或E6 ins33；A20，867 bp和900 bp）。EML4-ALK在腺癌患者中的表達頻率為16.13%（10/62），在不吸煙者中為19.23%（10/52），在缺乏EGFR和KRAS突變的腺癌患者中為42.80%（9/21）。EML4-ALK融合與非吸煙者（P=0.03），較年輕的發病年齡（P=0.03），和無EGFR/KRAS突變的腺癌（P=0.04）相關。ALK基因重排和EML4-ALK mRNA和蛋白表達水平之間的相關性一直存在爭議。該研究表明，EML4-ALK融合似乎是與ALK mRNA的表達水平緊密相關，因為在EML-ALK融合陽性的腫瘤中ALK mRNA表達水平更高（相比陰性腫瘤，P=0.001,8），相反，EML4的表達在群體中沒有差異。值得注意的是，他們也發現1例女性不吸煙腺癌患者的樣本中同時存在EGFR突變（外顯子19缺失）和EML4-ALK融合基因（亞型3b），提示這兩個基因組變化在癌癥的發生和發展中的作用還需要更加深入的研究[10]。

復旦大學腫瘤醫院進行了一項對東亞非吸煙肺腺癌中主要復發癌基因突變的研究[16]。52例不吸煙肺腺癌患者的手術切除標本，同時檢測EGFR、KRAS、NRAS、HRAS、HER2、BRAF、ALK、PIK3CA、TP53和LKB1突變。結果表明，41例腫瘤包含EGFR突變；3例攜帶EML4-ALK融合；2例有HER2插入；1例KRAS突變。所有突變相互排斥。未檢測到BRAF、NRAS、HRAS或LKB1突變，15例TP53突變，4例包含伴有EGFR突變的PIK3CA突變，針對目前存在的分別以EGFR、HER2和ALK突變為靶標的藥物，這個結果表明前瞻性突變檢測對個體化的靶向治療具有重要意義。

隨著對EML4-ALK研究的深入，引出的新問題越來越多，尤其是一些問題與研究者最初的設想背道而馳。EML4-ALK基因融合與EGFR和KRAS基因突變是排斥的，還是各自獨立發生的？EML4-ALK基因融合在正常組織中表達，在肺癌以外的其它腫瘤組織中表達，打破了其僅是NSCLC中的特征性基因改變這一最初的認識，使它在腫瘤的發生、發展過程中到底發揮何種作用變得越來越復雜[17]。這些問題影響EML4-ALK重排在NSCLC的發病，診斷和分子靶向治療中的作用。

4 ALK抑制劑的應用

ALK基因編碼一種受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase, RTK）。活化的ALK通過激活PI3K/Akt信號和MAPK信號通路的下游信號參與抑制細胞凋亡、促進細胞增殖[18]。深入研究ALK激酶活性和患者樣本中下游信號激酶的激活之間的相關性特別重要。

EML4-ALK可以作為一個潛在的治療靶點。單獨或組合應用ALK激酶抑制劑對攜帶EML4-ALK的NSCLC患者可能是有效的臨床治療手段。Soda等[19]研究了一種ALK抑制劑（WHI-P154）對EML4-ALK1陽性NSCLC的作用。結果表明WHI-P154顯著抑制表達EML4-ALK的BA/F3細胞的生長，在10 μmol/L濃度時迅速導致這些細胞死亡。WHI-P154以一種濃度依賴方式抑制EML4-ALK的酪氨酸磷酸化。將EML4-ALK亞型3b導入到IL-3依賴的BA/F3細胞中，然后將細胞暴露于另一個ALK激酶抑制劑（2,4-pyrimidinediamine）。結果發現BA/F3細胞迅速死亡。2,4-Pyrimidinediamine以一種濃度依賴方式抑制了EML4-ALK的激酶活性。人肺癌細胞株NCI-H2228表達EML4-ALK的亞型3a和3b，2,4-pyrimidinediamine抑制NCI-H2228細胞的生長也是以一種濃度依賴的方式。

Galkin等[20]評價了TAE684，一個高潛力的ALK激酶抑制劑，對攜帶EML4-ALK的細胞生長的影響。結果表明在3個表達EML4-ALK的細胞系中，TAE684只是明顯抑制H3122細胞系的生長并導致細胞凋亡，而且只有H3122細胞系中存在明顯的下游信號蛋白Akt和ERK1/2磷酸化的抑制。有趣的是，該研究發現TAE684只是導致STAT3磷酸化程度降至最小，由于STAT3對NPM-ALK介導的淋巴瘤生成是關鍵的，因此STAT3在攜帶EML4-ALK的NSCLC中到底有何作用，攜帶NPM-ALK和EML4-ALK的腫瘤之間到底何種信號不同尚需深入研究。

Kwak等[21]總結了一項涉及NSCLC患者的I期試驗研究。1,500例NSCLC患者中發現82例（5.5%）攜帶一個ALK重排，這些重排并不都是EML4-ALK，表明還有其它的ALK融合存在，如TFG-ALK和KIF5B-ALK。一種新型潛在的ALK激酶抑制劑：crizotinib（PF-02341066），被應用于該試驗。研究者們觀察到57%的應答率和8周內87%的疾病控制率[22]。平均治療時間為6.4個月，27例疾病穩定，46例部分緩解和1例完全緩解。所有患者MET陰性（另一個crizotinib靶點），表明治療是通過抑制ALK實現的。

除了crizotinib，其它TKI已被證明具有明顯的體內抗腫瘤活性。不幸的是，對相應的TKI來說，總有一小部分腫瘤從開始治療或在發生初級反應后就存在耐藥性。Choi等[23]報道了1例EML4-ALK陽性的NSCLC病例，應用crizotinib成功治療5個月后發生耐藥。患者28歲，男性，無吸煙史，診斷為肺腺癌，未攜帶EGFR突變，接受了常規化療。然而，經過6個療程的治療后腫瘤進展，檢測發現腫瘤表達EML4-ALK的亞型1。在口服crizotinib治療后1周，患者癥狀明顯好轉。然而5個月后，腫瘤突然開始恢復增長，導致胸腔積液的迅速增長和雙側肺部腫瘤進展。分析患者的胸腔積液樣本，發現在EML4-ALK激酶域存在兩個突變（野生型ALK的cDNA核苷酸4,374和4,493，分別發生了G→A和C→A的改變，頻率為41.8%和14.0%），每個都能賦予對ALK抑制劑的抗性。沒有發現任何EML4-ALK的cDNA同時攜帶這兩個突變，因此研究者認為每個突變是獨立發生的。因為無治療前基線數據，所以不知道抗性克隆屬于原發的還是繼發的。這例患者出現的對crizotinib耐藥突變表明，還需要其它ALK抑制劑靶向治療crizotinib耐藥的EML4-ALK基因融合病例。在這方面已經取得一些進展，這類藥物也正在研發過程中，包括新型ALK抑制劑[24]。

5 展望未來

Shaw等[25]研究證明EML4-ALK陽性與EGFR TKI耐藥相關。此外還發現，與無EML4-ALK基因融合或EGFR野生型腫瘤患者相比，EML4-ALK陽性的腫瘤患者對以鉑類為基礎的聯合化療顯示出相似的敏感性，整體存活率無差異。

目前看來，亞裔人群EML4-ALK基因融合發生率略高于高加索人群，同樣與不吸煙、較年輕的發病年齡相關。與性別、病理類型、腫瘤分化程度等因素的關系尚不明朗[26-31]。

許多臨床相關問題沒有解決，如是否ALK能單獨驅動腫瘤的發生、發展，或在腫瘤發展過程中是否有特定分子協同ALK發揮其功能。此外，由于各種ALK融合蛋白有不同的亞細胞定位（可能依賴于融合參與蛋白的性質），它們的下游信號通路可能是不同的[32]。

首要的問題是尋找到最佳途徑以檢測ALK融合的存在。現行檢測方法有多種：包括免疫組化、熒光原位雜交和RT-PCR。但是現在還沒有一種公認的簡便易行的標準檢測手段[33]。張緒超等[15]建立了一種高度敏感的PCR診斷方法可能有廣泛的應用前景。未來的工作需要確定標準的檢測方法，以便在肺癌中常規地診斷性檢測ALK融合。

其次，我們如何找到合適的患者進行治療呢？理想的情況是同時檢測三種目前最常見突變——KRAS、EGFR和ALK融合。現在提出了一種逐步交替方法來檢測肺腺癌，首先檢測KRAS突變（白人發生率為15%-30%，東亞患者的突變率約8%）。如果KRAS突變陽性，則不需要進一步的分子檢測（KRAS突變的腫瘤對ALK抑制劑的敏感性有待深入研究）。如果KRAS突變是陰性的，再檢測EGFR突變（白人發生率約10%，亞洲患者約30%）。如果是EGFR突變陽性，建議使用EGFR TKI治療。如果是陰性的，腫瘤再被評估ALK易位。如果ALK是陽性的，治療將使用ALK抑制劑，如果是陰性，這些三重陰性的腫瘤應考慮分析罕見的突變（如BRAF、MEK1、AKT1、PIK3CA等）和/或深入研究找出新的驅動突變[6]。

由于治療效果可能是個變量，在通路激活機制的基礎上，出現抗藥性幾乎是可以肯定的。目前缺乏對ALK結構信息的研究，包括ALK胞外區獨特的組織結構和ALK胞內域的晶體結構，還要考慮ALK的結晶過程[34]。研究ALK激酶域的晶體結構[35]，發現L1196M殘基突變可能會阻止crizotinib結合到ALK。但C1156Y突變的作用還不清楚，因為它似乎不太可能直接影響crizotinib結合到ALK。在體外，C1156Y突變對crizotinib耐藥的影響不像在體內那么強，表明在細胞中該突變可能需要與其它因素相互作用，才會有更高的藥物敏感性。需要詳細地分析揭開ALK融合蛋白中存在的大量差異，以確定將來的干預治療靶點[36]。

包括激酶抑制劑在內的抗腫瘤藥物的一個主要問題是毒性作用。Kwak等[37]和Butrynski等[38]均報道口服crizotinib（250 mg/2次/天）在患者中僅發生二級不良反應，最常見的不良反應為惡心、嘔吐、乏力、腹瀉。

總之，上述研究為成功治療ALK陽性的惡性腫瘤提供了一個樂觀的前景。在涉及ALK的癌癥患者群體中，一個標準的基因分型方法對制定更加個體化的治療方案將是非常重要的。將來的crizotinib和其它ALK抑制劑的臨床研究將會告訴我們是否它們是戰勝癌癥的新生力量[36]。

除了使用ALK抑制劑，發展一種同時抑制ALK信號通路多個靶點的治療策略也是至關重要的，還應發展針對ALK的單克隆抗體治療。此外，是否單獨使用ALK抑制劑或與其它激酶抑制劑組合使用才能有效地抑制腫瘤細胞生長和誘導凋亡呢？

顯然，采用靶向治療，我們將需要篩查腫瘤的大量的突變，完成總的基因組分析。需要正確處理組織來完成這樣的分析。隨著全球多機構和多學科的通力合作，將來應該有可能對腫瘤精確分子分型以確定合適的治療靶點，更有可能在治療前就預測出耐藥亞群[39]。