Livin及Caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達及臨床意義

劉若男 王莉莉 王莉英 李秀榮 張靖 陳奎生

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，由于卵巢癌發病隱匿，患者臨床明確診斷時大多數已經是晚期，嚴重影響患者的生命健康。Livin是新近發現的一種凋亡抑制蛋白家族(IAPs)成員，與Caspase結合發揮抗凋亡作用，其在正常成人組織中低或無表達，在某些惡性腫瘤細胞和轉化細胞中高表達，該基因可能在腫瘤的發生和發展中起著重要作用[1]。本實驗通過免疫組化SP法檢測Livin蛋白和Caspase蛋白在良、惡性卵巢上皮性腫瘤組織中的表達，旨在探討Livin和Caspase在卵巢癌發生發展的關系，為臨床治療及提高患者的生存率提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河南省腫瘤醫院病理科保存的2006年1月至2008年3月原發性上皮性卵巢腫瘤石蠟標本100例，臨床資料完整。其中惡性腫瘤76例，作為卵巢癌組，年齡24～72歲，平均年齡(52.80±8.45)歲，術前均未接受過化療或放療。組織學分型:漿液性囊腺癌46例，粘液性囊腺癌24例，子宮內膜樣腺癌6例。惡性卵巢腫瘤按FIGO分期標準(1988年):I期8例，II期16例，III期44例，IV期8例。組織學分級:高分化(G1)20例，中分化(G2)30例，低分化(G3)26例。另取良性卵巢上皮性腫瘤24例作為對照組，其中漿液性囊腺瘤18例，粘液性囊腺瘤6例。

1.2 方法 采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶染色法(SP法)。嚴格按照說明書進行操作。

1.3 結果判定 參照文獻[2]，光學顯微鏡下 Livin及Caspase-3免疫組化產物呈棕黃色細顆粒狀，定位于胞質，偶見于胞核。隨機觀察清晰的10個高倍視野，根據陽性細胞所占視野所有腫瘤細胞的百分比計算出每例標本的Livin及Caspase-3表達率。根據其表達率及染色強度分別記為:(-)無明顯陽性反應細胞或陽性細胞面積小于10%，染色淺;(+)陽性細胞面積大于10%，但小于50%，染色較深;(++)陽性細胞面積大于50%，染色深。

1.4 統計學方法 所有數據均采用SPSS 12.0統計軟件處理，計數資料采用χ2檢驗，等級資料的組間比較采用秩和檢驗，分析兩指標的相關性采用Spearman等級相關分析，以α=0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 Livin及Caspase-3蛋白在卵巢癌組及對照組中的表達卵巢癌組Livin蛋白表達率為81.58%，對照組33.33%，兩組之間差異具有統計學意義(P＜0.05)。Caspase-3在卵巢癌組及對照組表達的陽性率分別為47.37%和83.33%，兩者之間差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.2 卵巢癌中Livin蛋白表達與臨床病理因素的關系Livin蛋白在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期的表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05)，且腫瘤分化程度越低，Livin蛋白表達越強(P＜0.05)，伴淋巴結轉移者明顯高于無淋巴結轉移者(P＜0.05);但與卵巢癌的組織學類型無關(P＞0.05)，見表1。

表1 Livin蛋白表達與卵巢癌臨床病理指標的關系

2.3 卵巢癌組織中Livin與Caspase-3蛋白表達的相關性分析 在62例Livin蛋白表達陽性的卵巢癌組織中，Caspase-3蛋白的陽性表達率為41.94%(26/62);在14例Livin蛋白陰性表達組中，Caspase-3蛋白的陽性表達率為71.43%(10/14)。經Spearman相關分析表明二者為負相關(χ2=3.981，P＜0.05，r=-0.223)。

3 討論

多細胞生物體細胞數量恒定取決于細胞增殖與凋亡間的動態平衡，破壞平衡可導致腫瘤的發生。在惡性腫瘤病變中，細胞增殖和凋亡同時增加，但增殖速率明顯大于凋亡速率。當抑制腫瘤細胞增殖和/(或)促進腫瘤細胞凋亡，則會影響腫瘤的生長。Livin基因是一個新近發現的凋亡抑制基因，具有強大的凋亡抑制功能，其異常表達與多種人類腫瘤的發生發展及預后密切相關[3]，成為人們研究的一個熱點。

Livin是IAP家族中新近發現的一種凋亡蛋白，Livin基因位于人染色體20q13.3，全長4.6kb，包含7個外顯子和6個內含子。Livin抗凋亡活性就主要依賴于其BIR結構域。Livin在正常成人的大多數組織中(除胎盤)均不表達，表皮、淋巴、脾臟和黑色素細胞表達很低。在胎兒發育過程中多種組織高表達，如胎兒的腦、胸腺、腎和肝。Livin可能需要通過一系列的凋亡刺激物的作用來表現凋亡的抑制，其抑制凋亡的信號通路包括:外在途徑即細胞表面的死亡受體，內在途徑即細胞色素C依賴途徑和化療藥物途徑;細胞在接受到足夠的凋亡刺激信號后，Caspase-3、-7、-9的酶水解作用被激活而執行凋亡功能[4]。另有研究報道，Livin的RING指結構可引起Caspase蛋白的降解，發揮其抗凋亡作用。

大量研究表明，Livin的分布具有腫瘤組織特異性，在一些癌細胞系中呈現高表達，如淋巴瘤、HaCat細胞、MCF7乳腺癌細胞、前列腺癌、白血病以及宮頸癌、結腸癌、膀胱癌等，尤其在黑色素瘤細胞系C361和SK-Me129中表達水平最高[5]。本研究用免疫組化SP法檢測Livin蛋白在24例良性卵巢上皮性腫瘤、76例卵巢癌組織中，陽性表達率分別是33.33%和81.58%，卵巢癌組織中Livin蛋白表達明顯高于良性卵巢上皮性腫瘤，表明Livin和卵巢癌的發生、發展密切相關。提示Livin表達發生在卵巢癌惡性轉化的早期，表明Livin與卵巢癌的發生有關。Livin在卵巢癌組織中的表達可能抑制了異常突變的細胞的凋亡，從而擾亂了細胞生長和凋亡途徑，促使細胞逃離生長監控，導致腫瘤的發生。

國外許多研究表明，凋亡抑制因子Livin與多種腫瘤的預后及患者的存活時間密切相關，其表達程度與病程進展和不良的組織學相一致[6]。研究發現低分化卵巢癌中細胞凋亡明顯低于中、高分化卵巢癌，且存在多種調節因子的紊亂，認為凋亡及其調節因子的紊亂與卵巢癌的惡性行為有關，并影響預后。本研究中卵巢癌組織分化程度越低，其Livin蛋白表達越強，而Ⅲ、IV期卵巢癌組織中Livin表達顯著增高則進一步證實了這一點。Livin通過抑制腫瘤組織中正常細胞凋亡的作用，促進癌細胞增殖，進而增加了癌細胞的侵襲能力，其在腫瘤細胞中表達越高，對凋亡的抑制能力就越強，腫瘤細胞的存活能力和惡性程度就越高，就更易侵襲周圍組織而發生轉移。

Caspase蛋白家族是細胞內執行凋亡過程中最關鍵的環節之一，Caspase-3是細胞凋亡過程中的主要效應分子，它可以單獨或協同參與水解許多與凋亡有關的蛋白質。Caspase-3活化主要有兩條途徑:一是經細胞表面膜受體如Fas、TNFR1等活化;另一條途徑是死亡刺激因子作用下線粒體釋放細胞色素C。活化的Caspase-3執行效應Caspase的作用，非選擇性分裂水解其他蛋白、內源性核酸內切酶以及本身，激活DNA片斷因子，導致DNA降解、核漿碎裂、細胞凋亡[2]。本研究顯示Caspase-3蛋白在24例良性卵巢上皮性腫瘤、76例卵巢癌組織中，陽性表達率分別是83.33%和47.37%，卵巢癌組織中Caspase-3蛋白表達明顯低于良性卵巢上皮性腫瘤組織，提示Caspase-3和卵巢癌的發生、發展密切相關Livin與Caspases結合有高度的親和性和特異性，這依賴于BIR結構域的完整。BIR是一種新型的鋅指結構，而Livin中BIR結構是抗凋亡活性所必需。如BIR結構域單個氨基酸發生突變可導致 Livin與Caspases親和力下降，使Livin的抗凋亡能力明顯減低甚至消失[7]。另有研究報道，Livin的RING指結構可引起Caspases蛋白的降解，發揮其抗凋亡作用。本實驗結果表明，經Spearman相關分析發現，卵巢癌組織中Livin與Caspase-3蛋白表達呈明顯的負相關。提示在卵巢癌的演變過程中Livin可能直接作用于Caspase-3并抑制其活性，阻斷細胞的凋亡過程，從而促進了卵巢癌的癌細胞不斷增殖。

Livin與Caspases的異常表達與卵巢癌的發生、發展密切相關，Livin在卵巢癌中的高表達與淋巴結轉移及臨床病理分期密切相關，可能是影響卵巢癌預后的重要分子指標，有關Livin與Caspases對卵巢癌的發生、發展的詳細機制還需進一步研究。

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