基質(zhì)金屬蛋白酶蛋白在百草枯致肺纖維化大鼠肺組織中表達(dá)及其意義

杜妍，肖莉

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽 110004）

百草枯（paraquat，PQ）為有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑，對(duì)人有較強(qiáng)毒性，目前中毒機(jī)制尚不明確，無特效治療方案。基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類主要降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白酶，在生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)MMP3、MMP8與肺纖維化有著密切的聯(lián)系［1］。研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射百草枯可致大鼠肺纖維化，此病理過程與人類百草枯致肺纖維化過程極其相似，因此，本實(shí)驗(yàn)研究百草枯對(duì)肺組織病理改變的影響，進(jìn)一步研究MMP3、MMP8在百草枯致急性肺損傷及纖維化肺組織中的表達(dá)及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。百草枯（99.99%，貨號(hào)：856177-1G）購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。MMP3（貨號(hào)：bs-0413R）、MMP8（貨號(hào)：bs-1913R）抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立、分組及標(biāo)本處理

雄性 SD 大鼠40只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（295±20）g，隨機(jī)分為模型組（PQ組）和鹽水對(duì)照組（NS組），每組20只。NS組一次性腹腔注射生理鹽水8.5 mL/kg。PQ組一次性腹腔注射百草枯15.0 mg/kg。分別于給藥后5 d、28 d處死動(dòng)物，HE染色觀察肺纖維化程度，免疫組化法觀察各組動(dòng)物MMP3、MMP8蛋白表達(dá)。

1.3 肺泡炎癥、肺纖維化程度判斷

肺組織石蠟切片HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。按照Szapiel等［3］的方法評(píng)價(jià)肺組織病理變化嚴(yán)重程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無肺泡炎或無纖維化且肺組織受累面積為0記為“-”；輕度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積<20%記為“+”；中度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積20%～50%記為“++”；重度肺泡炎或纖維化且肺組織受累面積>50%記為“+++”。

1.4 免疫組化法檢測(cè)肺組織MMP3、MMP8蛋白表達(dá)

肺組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，然后按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0版統(tǒng)計(jì)軟件，肺組織HE染色肺泡炎或纖維化程度資料用秩和檢驗(yàn)Ridit方法，Ridit法是將按等級(jí)分組的資料，通過轉(zhuǎn)換成為一組連續(xù)性的計(jì)量資料，計(jì)算Ridit值（簡(jiǎn)稱R值），屬于一種非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法。肺組織免疫組化法觀察MMP3、MMP8蛋白表達(dá)資料以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織的病理學(xué)改變

對(duì)照組大鼠肺臟外觀大致正常，鏡下未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積。模型組大鼠5 d時(shí)肺組織外觀明顯腫脹，鏡下示肺泡間隔明顯增寬變形，肺泡間隔和肺泡腔內(nèi)重度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以單核/巨噬細(xì)胞為主，大部分形成炎癥灶，成纖維細(xì)胞增多，病灶內(nèi)已出現(xiàn)肺泡萎縮。28 d時(shí)外觀呈蒼白色，腫脹已基本消退，體積縮小，彈性更差，硬度增加，表面呈結(jié)節(jié)樣改變并可見條索狀凹溝，鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，成纖維細(xì)胞大量增生，纖維組織呈條索樣瘢痕改變，斑片狀分布，但外周肺實(shí)質(zhì)炎癥有更進(jìn)一步的吸收（表 1，圖 1）。

表1 各組大鼠肺組織H E染色肺泡炎或纖維化程度（n）Tab.1 HE staining of lung tissue of rats alveo litis orfibrosis（n）

圖1 各組大鼠肺組織H E染色的動(dòng)態(tài)變化 ×200Fig.1 The HE staining of lung tissue dynam ics×200

2.2 免疫組化法檢測(cè)MMP3、MMP8在大鼠肺組織內(nèi)的分布

MMP3、MMP8在正常組大鼠肺組織內(nèi)呈弱表達(dá)。模型組大鼠5 d時(shí)肺組織中MMP3、MMP8的表達(dá)增強(qiáng)，到28 d時(shí)已基本達(dá)到正常水平（表2，圖2、3）。

表2 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP3、MMP8蛋白表達(dá)（O D值）Tab.2 Rats ineach group immunohist ochemistry inlung tissue was observed mmP3，M M P8prot ei n expressi on（O D val ue）

圖2 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP3蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)變化（200×）Fig.2 Lung tissue of rats ineach group were observed by immunoh is tochem istry MM P3 prote in dynam ics（200×）

圖3 各組大鼠肺組織免疫組化法觀察MMP8蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)變化 ×200Fig.3 Lung tissue of rats in each group were observed by im munoh istochem istry MM P8 protein dynam ics×200

3 討論

百草枯化學(xué)名為 1，1′-二甲基 4，4′-聯(lián)吡啶陽離子鹽，為有機(jī)雜環(huán)類接觸性脫葉劑及除草劑［3］。百草枯對(duì)人有較強(qiáng)毒性，由于其中毒致死量小、無特效解毒劑、常規(guī)對(duì)癥治療效果極差，故死亡率較高，國(guó)外報(bào)道百草枯中毒病死率40%～50%［4］。重度中毒患者可在短時(shí)間內(nèi)死于多臟器功能衰竭，中度中毒時(shí)主要損害肺臟，對(duì)人有較強(qiáng)毒性，在對(duì)人體的損害中主要表現(xiàn)為肺組織的損傷，PQ經(jīng)胃腸道吸收入血后通過多胺攝取途徑可特異性聚集于肺臟，濃度比血液高6～10倍［5］，患者于染毒后24 h迅速出現(xiàn)肺水腫、肺出血及肺不張等急性肺損傷癥狀，并進(jìn)行性發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，患者如能度過1周左右的急性期，肺部損傷逐漸加重，發(fā)展為不可逆的肺間質(zhì)纖維化，后期多死于呼吸衰竭［6］。肺纖維化的病理特征是肺泡上皮的損傷和成纖維細(xì)胞增殖，目前發(fā)病機(jī)制尚不清，目前對(duì)百草枯中毒機(jī)制的研究主要集中在以下幾方面：氧自由基損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞因子及趨化因子、基因異常表達(dá)等方面。

MMPs是一類主要降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白酶，在生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。MMPs是一類高度保守的鋅離子依賴內(nèi)肽酶家族，至少有26種人類MMPs［7］。MMPs可以分為3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域：N端的前肽區(qū)，催化區(qū)和C端的類血結(jié)區(qū)。MMPs以無活性形式合成，被激活后才有活性。MMPs主要通過兩種途徑被激活，其一是N端的前肽區(qū)變構(gòu)或轉(zhuǎn)位，其二是N端的前肽區(qū)被酶切。它們被激活后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，同時(shí)也可以降解非細(xì)胞外基質(zhì)成分蛋白，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞受體、絲氨酸蛋白酶抑制劑和其他蛋白酶，從而調(diào)節(jié)這些化合物的生物活性。基質(zhì)金屬蛋白酶的這一作用可以預(yù)防或引發(fā)疾病，如癌癥、心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病和各種結(jié)締組織病［8］。多位學(xué)者在PQ致肺纖維化機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)某些基因表達(dá)異常，目前研究最多的是MMP2和MMP9，認(rèn)為它們是降解肺泡基膜主要成分IV型膠原的主要酶類，對(duì)肺組織的重構(gòu)有不可忽視的作用。與此同時(shí)對(duì)MMP3、MMP8的研究相對(duì)較少。Tomita等［4］對(duì)C57Black/6J大鼠鼻內(nèi)飼入不同劑量PQ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在染毒后的5 d內(nèi)，肺纖維化尚未形成，但已經(jīng)有基因表達(dá)的改變，其中包括MMP3和MMP8，因此本實(shí)驗(yàn)研究 MMP3、MMP8，探討 MMP3、MMP8與肺纖維化之間的關(guān)系。結(jié)果提示，肺纖維化的發(fā)生與MMP3、MMP8的異常表達(dá)直接相關(guān)，提示它們可能是PQ致肺纖維化的標(biāo)志物。

綜上所述，MMP3、MMP8蛋白在百草枯誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織中的表達(dá)增強(qiáng)，后進(jìn)行性下降至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)（染毒后28 d）時(shí)基本接近正常，提示MMP3、MMP8可能是PQ致肺纖維化的標(biāo)志物，對(duì)MMP3、MMP8的檢驗(yàn)將具有重要的臨床意義并進(jìn)一步指導(dǎo)治療。但本實(shí)驗(yàn)并未深入的研究MMP3、MMP8參與肺纖維化的分子生物學(xué)機(jī)制，這將是我們下一步實(shí)驗(yàn)工作的重點(diǎn)。

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