結腸癌中RASSF 1A基因啟動子甲基化及其臨床意義

王旭東,王海珠,徐 華,梁國棟,張 偉,朱寶平,房學東*,姜洪偉

(1.吉林大學第二臨床醫院普通外科,吉林長春 130041;2.長春中醫藥大學附屬醫院;3.內蒙古自治區醫院）

本研究探討結直腸癌組織中RASSF 1A基因啟動子甲基化和mRNA表達異常與結直腸癌病理生物學特征的關系,為闡明抑癌基因RASSF 1A基因在結直腸癌發生發展中作用及其分子機理提供有力科學實驗依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集我院2009年8月-2010年4月手術切除結直癌標本90例,均為腺癌,其中男性55例,女性35例,年齡42-78歲,平均62歲。組織來源和分組:分為三組(1）正常組;(2）癌旁組;(3）實驗組。按:①分化程度:分為高、中、低分化組。②腫塊大小:＞5 cm和 ≤5 cm。③臨床分期:按照Dukes分期進行分組。

1.2 方法

1.2.1 RASSF 1A基因表達的檢測:RT-PCR方法檢測RASSF 1A基因mRNA表達。

1.2.2 設計引物:針對RASSF 1A基因啟動子甲基化特異性PCR所設計的一組引物,使用引物設計軟件Primer3,該引物包括甲基化(Methylated,M）與非甲基化(Unmethylated,U）特異性引物各一對,由寶生物工程(大連）有限公司合成。分別以M、U標記,各對引物上下游起始位點、擴增片斷大小、引物序列如下:

甲基化引物設計:

M-上游引物:距轉錄起始點-43 bp至-17 bp

5′-CGTTGTTCGCGATTTTTGGTTTC-3′

下游引物:距轉錄起始點71 bp至92 bP

5′-ACCGATTACTTTAAAAATACGCG-3′

擴增片斷:342 bp

未甲基化引物設計:

U-上游引物:距轉錄起始點-44 bp至-18 bP

5′-GTTGTTGTTGTTTGTGAITTTTGGTTTT-3′

下游引物:距轉錄起始點72 bP至99 bP

5′-CCACTTACCAATTACTTAAAAAATACACA-3′

擴增片斷:351 bP

1.2.3 MSP測定DNA甲基化:按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳:條件為2.5%瓊脂糖凝膠,65 V恒壓電泳1 h 40 min。0.1%嗅化乙錠染色15 min,凝膠成像系統照相分析。

1.2.5 檢測甲基化位點狀況 MSP產物6 μ l及DNA Marker 1 μ l用含有嗅化乙錠1.5%瓊脂糖凝膠(穩壓80V）在TBE電泳工作液電泳約20 min,后在紫外燈下觀察結果,且用UVI凝膠成像系統攝影。

1.3 MSP結果的判斷甲基化特異性引物擴增出產物,為完全甲基化;僅未甲基化特異性引物擴增出產物,為未甲基化;兩對引物均擴增出產物,為部分甲基化[1]。

1.4 統計學處理所有數據均采用SPSS 16.0統計軟件,組間比較用 χ2檢驗,P＜0.05有統計學意義。

2 結果

見表1、2,圖1,2。表1可以看出,1）組和2）組比較,P=0.001,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和癌旁組織存在顯著的差異,P＜0.05;1）組和3）組比較,P=0.008,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和正常組織存在顯著的差異,P＜0.05.說明RASSF 1A基因啟動子甲基化結直腸癌的發生發展有關。

圖1 檢測結直腸癌組織、癌旁組織及正常組織中總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 MSP方法檢測結直腸癌組織、癌旁組織及正常組織中RASSF 1A基因啟動子甲基化狀態癌旁組織和癌組織關系

表1 RASSF 1A基因甲基化與結直腸正常組織,

表2可以看出,按組織分化分組(高或中分化腺癌為一組,低或未分化腺癌為一組）,兩組的甲基化頻率差異有統計學意義(P＜0.05）。按浸潤深度分組(T1-T2和T3-T4各為一組）,甲基化頻率差異無統計學意義(P＞0.05）。按臨床分期分組(A和B期和C和D期各為一組）,兩組的甲基化頻率差異有統計學意義(P＜0.05）。

表2 RASSF 1A基因甲基化與結直腸癌的關系

3 討論

隨著腫瘤研究的深人,人們發現除了DNA突變等遺傳學改變外,基因甲基化和組蛋白乙酰化等不涉及DNA序列改變的表觀遺傳學機制在部分腫瘤的發生中可能起著至關重要的作用[2]。真核生物DNA甲基化水平與腫瘤關系密切,啟動子區高甲基化能導致抑癌基因表達沉默,這是腫瘤發生的關鍵事件[3]。3p21等位基因缺失發現了一系列的從小到大的腺瘤的關系,盡管這樣,這個關于3p21和RASSF 1A LOH得研究和總體的RASSF 1A基因改變一樣,但是與一系列早期和晚期癌相關聯,尤其是RASSF 1A基因片段的真實性[4]。RASSF1A基因定位于3p21,是Ras基因超家族的成員,發揮著抑癌基因的作用。與啟動子的CpG島甲基化的分析,RASSF 1A的啟動子甲基化在早期結直腸癌組織中表達較多[5]。RASSF1A基因定位于3p2113,是Ras基因超家族的成員,發揮著抑癌基因的作用[6]。RASSF 1A基因改變破壞了細胞周期、分化、去分化、細胞凋亡之間的平衡,導致細胞無控制性生長。早期抑癌基因失活,隨后各種癌基因激活[7]。

本研究得出結果是:癌組織組和癌旁組比較,P＜0.05,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和癌旁組織存在顯著的差異;癌組織組和正常組比較,P＜0.05,說明RASSF 1A基因啟動子甲基化在癌組織和正常組織存在顯著的差異。高、中分化組和低、未分化組比較,兩組的甲基化頻率差異有統計學意義(P＜0.05）。T1、T2組 和T3、T4組比較,兩組甲基化頻率差異無統計學意義(P＞0.05）。A、B期組和C、D期組比較,兩組的甲基化頻率差異有統計學意義(P＜0.05）。

因此,RASSF 1A啟動子區CpG島的高頻率的甲基化在結值腸癌的疾病發生中起著是非常重要的作用,RASSF 1A基因作為一個抑癌基因,該基因表達下降可能與結直腸癌的分化程度和浸潤、轉移情況密切相關,因此該基因在結直腸癌發病機制中的作用,成為結直腸癌的早期診斷以及預后判斷的很關鍵的輔助手段,成為結直腸癌新的腫瘤標記物,而甲基化抑制劑也有望成為結直腸癌治療的新方法。

[1]Mehlen P,Rabizadeh S,Snipas SJ,et al.The RASSF 1A gene product induces apoptosis by a mechanism requiring receptor proteolysis[J].Nature(1998）395:801.

[2]Prabhu JS,Korlim arla A,Banerjee A,et al.Gene specific methylation:Potentialm arkers for colorectal cancer[J].Int J Biol Markers,2009,24(1）:57.

[3]Hibi K,Nakayama H,Kodera Y et al.CDH13 promoter region is specifically methylated in poorly differentiated colorectal cancer[J].Cancer,2004,90(3）:1030.

[4]Norrie M W,Hawkins N J,Todd A V,et al.Inactivation of p16IN K4a by Cp G hypermet hylation is not a f requent event in colorectal cancer[J].J Surg Oncol,2003,84(3）:143.

[5]Van Engeland M,Roemen G M,Brink M,et al.K2ras mutations and RASSF1A promotermethylation in colorectal cancer[J].Oncogene,2002,21(23）:3792.

[6]Chen J,Rêcken C,Lofton2Day C,et al.Molecular analysis of APC promoter methylation and protein expression in colorectal cancer metastasis[J].Carcinogenesis,2005,26(1）:37.

[7]Noda H,M ash im a R,et al.Promoter hyperm ethylat ion of tum orrelated genes in sporadic colorectal cancer in young patients[J].J Exp C lin Cancer Res,2007,26(4）:521.