泰索帝對甲狀腺未分化癌細胞系作用的蛋白質組學研究

付言濤,孫 輝,鄭海波,趙吉生

(1.吉林大學中日聯誼醫院甲狀腺外科,吉林長春 130033;2.吉林大學第二臨床學院麻醉科）

應用蛋白質組學技術,可從整體上定性和定量檢測分析甲狀腺腫瘤細胞經化療藥物作用前后細胞內蛋白質分子的變化,在蛋白水平進一步探討藥物作用的機制及尋找新藥靶點有重要的意義。泰索帝是一種紫杉類抗腫瘤藥物,臨床研究提示它能夠改善甲狀腺未分化癌的預后,但尚無從整體蛋白質水平上對其作用的機制進行相關研究。

本實驗擬從蛋白質組學水平觀察泰索帝作用甲狀腺未分化癌細胞前后蛋白表達譜的變化,探討泰索帝對人甲狀腺未分化癌細胞的作用機制,從蛋白質組學角度進一步深化對泰索帝抗腫瘤作用機制的認識。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及試劑 人甲狀腺未分化癌細胞系(TA-K）由日本東北大學醫學部第二外科惠贈;變性劑UREA(尿素）,Thiourea(硫脲）,表面活性劑CHAPS,載體兩性電解質ampholyte,還原劑TBP(三丁基膦）,還原劑DTT(二硫蘇糖醇）,Iodoacetamide(碘乙酰胺）,SDS(十二烷基磺酸鈉）,Arc(丙烯酰胺）,PDA(哌嗪雙丙烯酰胺）,TEMED(催化劑）,APS(過硫酸胺）,礦物油,低熔點瓊脂糖,ReadyStripTM IPG膠條(17 cm）均購自美國Sigma-Aldrich公司;Bio-Rad AC DC蛋白定量試劑盒購自BIO-RAD公司;IPG膠條購自BIO-RAD公司;泰索帝購自法國安萬特公司。

1.1.2 主要儀器有PROTEAN IEF系統組件(BIORAD公司）;PROTEANⅡxi系統組件(BIO-RAD公司）;4700TOF-TOF質譜儀(ABI公司）;GS-800校準型光密度掃描成像系統(BIO-RAD公司）等。

1.1.3 主要溶液有細胞培養液(WE,10%胎牛牛血清）;細胞樣品裂解液(7 M UREA,2 M thiourea,4%w/v CHAPS,40 mM Tris堿,與1%v/v蛋白酶抑制劑的混合液）;水化液(8 M urea,2%w/v CHAPS,20 mM DTT,0.2%v/v Bio-lyte 3-10,0.002%痕量溴酚藍）。平衡緩沖母液(50 mM Tris-HCl,pH 8.8,6 M urea,30%甘油,2%SDS）;12%SDS-PAGE凝膠緩沖液(12%Arc,0.38 mmol/L Tris(pH 8.8）,0.1%SDS,0.08%APS,0.04%TEMED）。

1.2 蛋白質組學研究

1.2.1 樣品制備 當貼壁生長于WE培養液中的TA-K細胞處于生長對數期時,將泰索帝以0.01 μ g/mL的濃度加入細胞培養液,共同培養72 h.對溶媒組加入等體積的0.002 6%乙醇濃度溶液。胰蛋白酶消化細胞,收集,磷酸緩沖液(PBS）洗滌、離心(1 500×g,10 min）3次。加入裂解緩沖液(1.5×106個細胞大約加入 100 μ L裂解液）,吹打混勻.液氮中反復凍融3次,在室溫下融化。加 50 μ g/ml RNase及200 μ g/ml Dnase,4℃放置 15 min。經高速離心 15 000轉,15 min,取上清,采用Bio-Rad RC DC蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。分裝至 Eppendof管里保存在-80℃備用

1.2.2 膠條溶脹與水化 17 cm水化盤中加入含有100 μ g蛋白的 400 μ L水化液,將IPG 膠條覆蓋到液面上,水化盤置于PROTEAN IEF電泳儀中,被動水化,20℃過夜(＞12 h）.

1.2.3 第一向等電聚焦 將充分溶脹的 IPG膠條取出,置于聚焦盤的相應聚焦槽中,再將聚焦盤置于PROTEAN IEF電泳儀中,20℃、60 kVh進行等電聚焦.

1.2.4 第二向SDS-PAGE取出聚焦好的IPG膠條,經含有1%DDT和5%碘乙酰胺的平衡緩沖液平衡30分鐘,以還原蛋白巰基,移至預先灌注好的12%SDS-PAGE凝膠頂端,與膠面完全接觸,將凝膠移至垂直電泳槽內.起始電流為10 mA/gel,30分鐘后,加大電流至24 mA/gel,待指示劑達到底部邊緣時停止電泳.取出凝膠,切角做記號.

1.2.5 銀染 程序設置如下

1.2.6 圖像掃描與分析 凝膠經膠體銀染色后,使用PowerLook 2100XL型光密度掃描儀和PHOTOSHOP CS軟件對凝膠進行掃描成像。在PDQuest雙向電泳分析軟件的輔助下,對圖像進行背景消減、斑點檢測、匹配、獲取斑點位置坐標等分析。蛋白質點的量表示為該點的所有像素強度值的總和,并將各點含量表示為相對含量,即單個蛋白質點的量占該塊膠內所有蛋白質點總量的百分數。

1.2.7 差異蛋白質點的選擇 實驗共重復3次,每次均采用相同實驗條件,以保證較好的可重復性。實驗組與對照組各選定一塊“平均膠”作為基準膠。所謂“平均膠”即通過對組內各塊凝膠進行匹配分析,蛋白質點顯示比較均勻,雜質斑點少,最能體現該組蛋白質點分布狀態的一塊凝膠。差異蛋白質點的選擇借助圖像分析軟件,以平均膠為基準,參考其它膠,選擇組間表達差異明顯,組內表達含量穩定、位置恒定的點作為目標點。確定差異點后在凝膠上切取相應的點,去離子水洗滌,甲醇固定,-80℃凍干保存。

1.2.8 蛋白質分子的檢測 采用MALDI-TOF-S進行蛋白質肽質量指紋譜的分析,蛋白質的鑒定、質譜打分結果和肽段匹配信息等以MASCOT為搜索引擎在NCBInr數據庫檢索(www.matrixscience.com）。

1.3 相關分子的免疫組化研究

根據質譜分析、蛋白鑒定結果,選取兩種與細胞凋亡或藥物作用相關的蛋白質,購買抗體,進行免疫組化染色。每種蛋白質染色分三組,正常細胞,乙醇對照組細胞,加泰索帝組細胞。細胞培養72 h,胰蛋白酶消化,PBS沖洗3次,離心收集細胞鋪片,用冷丙酮固定10 min,Triton-X 100洗10 min,PBS洗5min×3次;用3%H2O2孵育25 min,阻斷內源性氧化酶,PBS洗 5 min×3;正常羊血清50 μ l/片滴于組織片上,室溫下孵育20 min,封閉非特異性位點;倒去多余血清,分別滴加選定的蛋白抗體,50 μ l/片,室溫 1小時,PBS洗5 min×3;滴加生物素化羊抗兔IgG與玻片上 ,50 μ l/片 ,37℃30min,PBS 洗5 min×3;滴加辣根過氧化物酶(HRP）標記的親和素,50 μ l/片,37℃30分鐘,PBS洗5分鐘×3;DAB顯色,蒸餾水終止反應,蘇木素復染核,弱氨水中分化/鹽酸返藍,酒精逐級脫水,二甲苯透明,樹膠封片。顯微鏡下觀察其表達情況。

1.4 Western blot檢測蛋白表達

各取50 μ g蛋白 ,上樣于12%SDS-PAGE,再轉移至硝酸纖維素膜,5%脫脂奶粉封閉1小時,加入蛋白抗體,4℃過夜,次日用TBS洗滌3次(每次15分鐘）,加入ECL顯色液,X光膠片曝光沖洗,以β-actin做內參照。

2 結果

2.1 雙向電泳凝膠圖

實驗共重復3次,泰索帝0.01 μ g/mL作用TA-K細胞72 h后的實驗組與對照組分別得到3幅雙向電泳凝膠圖(圖1）,以平均膠為參考標準,凝膠圖像匹配率分別為80.5%(泰索帝組）和78.5%(溶媒組）。目前認為,凝膠圖像匹配率在75%以上即可判定圖像重復性較好。由PHOTOSHOP CS軟件和PDQuest雙向電泳分析軟件2.2質譜分析,質譜分析結果見表1。

圖1 泰索帝作用前后2-DE凝膠圖

表1 差異蛋白質譜分析結果

實驗組與對照組相比較,經泰索帝處理后,表達明顯上調的蛋白有:多聚(ADP-核糖）聚合酶[poly(ADP-ribose）polymerase,PARP],ADP-核糖焦磷酸酶(ADP-ribose pyrophosphatase）,matrin 3,細胞凋亡易感蛋白(cellular apoptosis susceptibility protein,CAS）。表達下降蛋白有:熱休克蛋白27(heat shock proteins 27,HSP27）,未命名蛋白質(unnamed protein product）。

2.2 PARP與HSP27免疫組化染色

選取PARP抗體TBX2與HSP27抗體,對正常組,乙醇對照組,泰索帝組細胞進行免疫組化染色比較。PARP染色顯示,正常組和乙醇對照組PARP變化不大,泰索帝組較乙醇對照組棕色顆粒明顯明顯增多(見圖2、圖3）。HSP27染色顯示應用泰索帝作用后,HSP27棕色顆粒較正常組和乙醇組減少(見圖4,圖5）,與2-DE灰度變化相一致。

2.3 PARP與HSP27蛋白水平分析

應用PARP抗體與HSP27抗體,對乙醇對照組、泰索帝組蛋白質進行Western blot檢測(重復2次）,檢測結果顯示,泰索帝能夠增加PARP的表達,降低HSP27的表達(圖6）。

圖2 溶媒組PARP染色(×40）

圖3 泰索帝組PARP染色圖片(×40）

圖4 溶媒組 HSP染色(×40）

圖5 泰索帝組HSP染色(×40）

圖6 PARP與HSP27免疫印跡檢測

3 討論

甲狀腺未分化癌(ATC）是高度惡性的腫瘤,其化療在腫瘤局部控制與延緩遠處轉移上具有重要的意義。但目前的化療藥物與化療方案,效果欠佳,并不能明顯的改善ATC的預后。泰索帝是最應用臨近床的一種紫杉類化療藥物,在體外對多種細胞系顯示細胞毒性作用,可以直接誘導細胞凋亡,其對非小細胞肺癌、晚期乳腺癌、卵巢癌、胃癌等臨床效果顯著,化療效果明顯優于不含泰索帝藥物的方案。曾有臨床試驗證實,紫杉醇較其它化療藥物能夠延長ATC的生存期[2-4]。且有研究證實,ATC之所以耐藥,是因為他能夠合成P-gp和MRP[5],這兩種蛋白能夠把化療藥物排出細胞外,泰索帝細胞內濃度是紫杉醇的3倍,應當是一個比較有希望的化療藥物。既往研究證實對ATC有明顯的抑制作用[6-7]。

本實驗通選擇最佳藥物作用濃度0.01μ g/mL,作用時間72小時,與對照組進行蛋白質組學研究。2-DE顯示有9個蛋白差異點,應用質譜分析,6個蛋白點質譜顯示陽性。灰度分析結合質譜結果顯示,上調的蛋白質有PARP,ADP-核糖焦磷酸酶,matrin 3,CAS;下調的蛋白質有HSP27,unnamed protein product。免疫組化與Western blot證實PARP和HSP27的變化與2-DE、質譜分析蛋白鑒定結果相一致。

3.1 多聚(ADP-核糖）聚合酶(PARP）

在細胞受到外界損傷因素作用時,DNA發生斷裂,PARP結合到DNA斷裂口,其催化活性被激活,以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide,NAD+）為底物,催化其裂解為二磷酸腺苷核糖(ADP-ribose）和尼克酰胺兩部分,并將ADP-ribose轉移至受體蛋白谷氨酸殘基上,對多種受體蛋白進行修飾,如染色質蛋白多聚(ADP-核糖）基化后,活性受抑制并與DNA分離、組蛋白多聚(ADP-核糖）基化后,可使染色質結構松散修飾后受體蛋白,進而發生一系列級聯反應,使細胞對外界刺激作出應答。如果PARP本身發生多聚(ADP-核糖）基化后,因電荷排斥作用從DNA斷口脫落,與DNA分離。PARP可作為細胞內有效監測DNA損傷的分子感受器(molecular sensor）,修復損傷或誘導細胞凋亡。

Caspase指的是半胱天冬酶,被認為是凋亡的中心實施者,其執行凋亡的功能依賴于底物蛋白的酶解活性,在Caspase的級聯反應中,最終均有Caspase-3的活化。PARP是活化了的Caspase-3的底物之一。在細胞凋亡過程中,Capase-3酶解PARP,使其裂解為2個片段(89 kDa和24 kDa）。24 kDa的PARP片段含有PARP的結合區域,結合到DNA鏈的斷口,因24 kDa的片段缺乏自身修飾域,不能被殘存的PARP多聚(ADP-核糖）基化,因此,24 kDa片段將不容易從DNA鏈的斷口釋放出來,凍結了DNA斷口,使DNA修復酶不能接近,不能對破裂的DNA片段進行修復,促進凋亡的發生。裂解PARP形成的89 kDa片段,因不含結合域,斷裂的DNA不能使其活化,防止了細胞內NAD和ATP的過度消耗,為細胞凋亡保存了能量。因此PARP裂解可作為凋亡早期的敏感指標。當大量DNA損傷得不到有效修復時,大量PARP進行自身修飾,集聚的PARP激發caspase對其進行剪切,即緊隨PARP核糖化之后PARP便發生了蛋白水解作用,其機制為聚ADP-核糖可增加caspase與PARP的結合力,促進PARP蛋白酶的水解,從而推動細胞凋亡的發生,PARP的”細胞保護”功能便發生了變化[8-9]。這一作用形式,使細胞根據受損程度作出反應,損傷不嚴重時,誘導細胞進入生長休止狀態,修復損傷,以利于細胞功能的恢復;損傷嚴重時則放棄修復,使細胞進入凋亡。

另有研究顯示PARP可以抑制P53的降解誘發細胞凋亡。許多實驗已證明在幾種不同的生理條件下通過表達P53可啟動細胞凋亡,但P53蛋白半衰期極短,在細胞內迅速降解,因而正常細胞內濃度極低。DNA的斷裂激活PARP,細胞內爆發大量的核糖化反應,PARP誘發P53基因mRNA蛋白使之發生聚ADP核糖化反應,減少了 P53的降解。另外Malanga等[10]研究顯示PARP與P53在胞內分布具有相關性,PARP可調控P53與DNA的結合力,調節P53的功能。

本實驗研究顯示在泰索帝的作用下,甲狀腺未分化癌細胞系中PARP表達上升,這與Negri等研究VP16誘導Hela細胞凋亡過程中,胞內被自身修飾的PARP大量增加相一致,考慮可能與泰索帝的藥物作用,使細胞DNA受損,促使PARP的大量自身修飾,促進凋亡的發生有關。

3.2 熱休克蛋白27(HSP27）

HSP27分子量(27kDa）,是小分子熱休克蛋白(small HSPs）sHSPs亞家族中的重要一員,參與調節細胞的增殖、分化和細胞凋亡的信號轉導等。研究證實HSP27與抗腫瘤凋亡和腫瘤耐藥有關。

本組實驗證實,泰索帝作用后HSP27蛋白下調,同時有研究顯示,ATC的耐藥機制和P-gp有關,HSP27還可降低細胞內P-gp的表達,降低細胞的耐藥性,對HSP27的研究,有可能改善ATC對化療藥物的耐受性。

3.3 ADP-核糖焦磷酸酶

ADP-核糖焦磷酸水解酶亞家族可水解ADP-核糖,調控體內ADP-核糖的水平,維持細胞正常代謝。ADP-核糖是 NAD+、環形ADP-核糖和聚ADP-核糖的酶催化代謝物。細胞內高水平的ADP-核糖使體內蛋白質產生非催化型的ADP-核糖化,從而導致蛋白質功能的失活,此外高水平的ADP-核糖還會干擾正常ADP-核糖依賴型酶的生理功能。例如肌動蛋白的聚合可通過在半胱氨酸的ADP-核糖化而被抑制;ADP-核糖化的組蛋白H1的可作為聚ADP-核糖聚合酶的延長識別位點。此外,酶催化的ADP-核糖化也具有某些毒害作用,如在某些系統中的導致凋亡作用和介導細菌性毒素的細胞毒害作用。

本組研究中泰索帝藥物作用后ADP-核糖焦磷酸酶的升高,可能是由于多聚藥物作用后PARP明顯升高,繼發ADP酶的升高有關。

3.4 Matrin 3

matrin 3是一個高度保守的核基質DNA結合蛋白,具有正電荷的N末端和高度的帶負電荷的C末端[14]。它在信使核糖的與其它核基質蛋白的相互作用中,形成細胞核內相互作用[15]。據報道,在細胞核內,matrin3與肌苷特異性RNA結合蛋白p54和剪接因子PSF形成了一個復合體,形成的復合體可以把超編輯RNA固定核基質上,同時有選擇性地釋放剪輯mRNAs。matrin3同其它基質蛋白相同,可能參與前體mRNA剪接。在生理情況下matrin 3上的絲氨酸-208,絲氨酸-596,絲氨酸-598,絲氨酸-604可被磷酸化[15],事實上在小鼠腦內N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA）受體激活后,蛋白激酶A將matrin3磷酸化,誘導其降解。蛋白激酶A抑制劑H-89可防止NMDA誘導matrin 3磷酸化和降解,以及神經元死亡。即蛋白激酶A介導的matrin 3磷酸化,作為一種快速的方式傳遞信息,在生理情況下從突觸含有NMDA受體傳遞到細胞核,并在病理情況下誘導神經元死亡。最近應用蛋白質組學研究發現[16],Matrin-3是鈣調素結合蛋白與caspase-3的下游底物,功能受與細胞分裂有關的鈣調蛋白和caspase的調節。

本組研究中發現,TA-K細胞經泰索帝藥物作用后matrin 3蛋白表達上調,matrin 3參與RNA的代謝,與細胞凋亡有關,具體藥物作用后matrin 3是否有促進凋亡的作用或抑制凋亡的作用,還有待于進一步研究。另外matrin 3能夠使神經元壞死,matrin 3的變化是否與泰索帝具有神經系統毒性作用有關,尚待進一步研究證實。

3.5 細胞凋亡易感蛋白(CAS）

CAS是由hCAS/CSE1L基因編碼的一種酵母基因CSE1人源性同系物。在研究乳腺癌細胞對抗藥物毒性引起的細胞凋亡中首次被克隆發現,和細胞增殖和凋亡的多種過程有關[17-18]。CAS在增殖細胞中高表達,在靜止細胞和組織中處于低水平。研究顯示CAS的表達能夠促進細胞的凋亡,抑制細胞生長增殖,可作為腫瘤細胞的一種”保護機制”[19]。

Tanaka等[17]研究證實CAS(hCAS/CSE1L）與P53的一個靶啟動子亞群有關,其中包括PIG3。CAS的降解使P53靶啟動子的轉錄減少,啟動子所引起的凋亡相關的激活減少,對細胞凋亡具有抑制作用。另外hCAS/CSE1L活性抑制增加PIG3基因的的組蛋白H3賴氨酸27的甲基化。CAS是一種核質的轉運因子,與染色質相關,是異染色質延伸的阻遏蛋白。因此CAS能夠選擇性的激活P53凋亡相關基因的轉錄,促進凋亡的發生。

綜合分析以上結果,泰索帝在分子水平上可能在以下方面對甲狀腺未分化癌細胞系TA-K細胞系產生作用:①泰索帝可能導致細胞DNA損傷,大量PARP積聚,產生細胞凋亡或死亡。同時PARP的集聚導致ADP-核糖增多,ADP-焦磷酸酶繼發性升高。②通過PARP,CAS,HSP調節P53的表達與代謝,促進細胞凋亡。③下調HSP27使DAXX的活性升高,促進細胞凋亡。④泰索帝影響細胞核內外物質轉運,以及細胞核基質的蛋白的調節,影響細胞核內核糖核酸的代謝。⑤HSP27與抗腫瘤耐藥有關,泰索帝能夠下調HSP27,改善ATC抗腫瘤藥物的敏感性。另外泰索帝作用后Matrin-3升高,Matrin-3與NMDA信號途徑有關,是否與化療藥物的神經毒性有關,尚需進一步研究。

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