結(jié)核分枝桿菌固液雙相培養(yǎng)基的研究

趙大力,韓中波,周亞麗

(1.長春國際旅行衛(wèi)生保健中心,吉林長春 130062;2.吉林市結(jié)核病防治研究所,吉林吉林 132011）

結(jié)核病是嚴重危及全球的公共衛(wèi)生問題之一,高耐藥性結(jié)核病的流行,成為結(jié)核病診斷和治療的難點。結(jié)核菌的培養(yǎng)和藥敏結(jié)果,在結(jié)核病的防治中起著重要作用[1]。目前公認的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法有兩種,一是液體培養(yǎng)基快速檢測法,其營養(yǎng)成分高,培養(yǎng)速度快,一般僅需10-20天,藥敏僅需10天。缺點是價格昂貴,不能客觀觀察結(jié)果,需特殊儀器(設備與培養(yǎng)基均需進口）,其次是藥敏試驗種類少。二是改良羅氏培養(yǎng)法,是我國普及通用的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)方法,為固相培養(yǎng)方法,是利用自制培養(yǎng)基在直視觀察下,結(jié)核桿菌的菌落生長情況。其優(yōu)點是藥敏試驗種類廣泛,可以選擇出敏感藥物,以指導臨床化療方案的制定、價格低廉,但缺點是時間長,培養(yǎng)需6-8周,藥敏時間一般又需4周。我們針對性地開展二者優(yōu)勢互補作用的探討,研究結(jié)核分枝桿菌固液雙向培養(yǎng)基。

1 材料和方法

1.1 7H9液相培養(yǎng)基的制備7H9干粉培養(yǎng)基購自美國sigma公司 ,取干粉2.35 g,蒸餾水溶解后加入2 ml甘油,蒸餾水補足至450 ml,高壓滅菌、待冷卻后 ,按 50 μ g/ml加入羥芐青霉素 、10 μ g/ml加入兩性霉素B,營養(yǎng)增強劑(OADC）50 ml混勻,置 4℃冰箱備用。

1.2 液體PNB培養(yǎng)基配制取0.5 gPNB加無菌蒸餾水10 ml溶解后,加90 ml 7H9液體培養(yǎng)基內(nèi),分裝中號試管,置4℃冰箱備用。

1.3 固液雙相培養(yǎng)基的配制接種菌株前制備,以改良羅氏培養(yǎng)基為基礎,加入7H9液相培養(yǎng)基4 ml(約占斜面的一半）。

1.4 標準菌株及菌懸液的制備用接種環(huán)挑取菌落若干,于含有2滴 0.5%Tween80生理鹽水試管內(nèi),用圓頭玻棒,在試管底部研磨成糊狀,用生理鹽水將菌液稀釋成1 mg/ml菌懸液,再用生理鹽水作梯度稀釋,H37Rv制成為10-1-10-8mg/ml各種不同濃度菌懸液。其他分枝桿菌制成10-3mg/ml菌懸液備用。

1.5 基礎試驗將雙相培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶打開,取上述菌懸液0.2 ml,分別接種在兩種不同(改良羅氏和固液雙相）的培養(yǎng)基上,各接種2組。置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng),1周內(nèi)每天觀察一次結(jié)果,記錄結(jié)核桿菌在兩種培養(yǎng)基上的生長情況。

1.6 臨床標本試驗取本院結(jié)核科患者晨痰1份.于無菌試管內(nèi),加2%氫氧化鈉2-4倍,用吸管充分混勻后置37%溫箱30 min(其間混勻2次）使之完全液化。取液化后試管內(nèi)中層痰液0.2 ml,分別接種于固液雙相培養(yǎng)基、羅氏培養(yǎng)基和PNB培養(yǎng)基,每份2瓶,置37℃溫箱培養(yǎng),每周記錄陽性數(shù)和污染數(shù)至8周為止,并記錄每份標本的初期生長時間。PNB培養(yǎng)基不生長者為人型或牛型結(jié)核桿菌。

1.7 藥物敏感性實驗改良羅氏培養(yǎng)基藥敏實驗按常規(guī)絕對濃度法操作,藥物濃度分別為INH(1、10 μ g/ml）、SM(10 、100 μ g/ml）、RFP(50 、250 μ g/ml）、EMB(5、50 μ g/ml）,固液雙相培養(yǎng)基藥敏實驗 ,將藥物加到液體培養(yǎng)基中,藥物終濃度為INH(0.2 μ g/ml）、SM(2 μ g/ml）、RFP(1 μ g/ml）、EMB(4 μ g/ml）。并記錄每份標本的初期生長時間,對各種藥物的耐藥情況。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核桿菌在固液雙相培養(yǎng)基上生長的情況H37Rv 10-1mg/ml菌液在接種后第3天液相培養(yǎng)基中段略變混濁,有5-8個白色顆粒狀菌落出現(xiàn)。第5天即有15-20個菌落,8天時中段呈乳白狀混濁,轉(zhuǎn)動試管可見無數(shù)菌落。固相在第6天出現(xiàn)明顯小菌落,第9天布滿斜面。菌落略粗糙,與改良羅氏培養(yǎng)基上菌落相同。將液相和固相菌落挑出分別涂片抗酸染色,均呈典型抗酸桿菌,但前者有索狀形成,后者菌體稍短。

2.2 臨床標本分離培養(yǎng)結(jié)果見表1。

表1 臨床標本分離培養(yǎng)結(jié)果

經(jīng)統(tǒng)計學分析兩種培養(yǎng)基的污染率無顯著性差異(P＞0.05）

2.3 固液雙相培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基生長速度的比較,結(jié)果見表2。固液雙相培養(yǎng)基的固相培養(yǎng)基結(jié)核菌生長稍晚于液相培養(yǎng)基,但優(yōu)于羅氏培養(yǎng)基。

表2 固液雙相培養(yǎng)基和改良羅氏培養(yǎng)基生長速度的比較

結(jié)核分枝桿菌在固液雙相培養(yǎng)基平均生長時間14.4天,改良羅氏培養(yǎng)23.5天,前者平均生長快9.1天,二者有顯著性差異(P＜0.01）。

2.4 結(jié)核分枝桿菌在兩種培養(yǎng)基上的藥敏情況對比分析見表3。應用固液雙相培養(yǎng)基進行藥敏實驗,報告的平均天數(shù)為11.7天,改良羅氏培養(yǎng)基進行藥敏平均為20.5天,提前了8.8天。

表3 兩種方法測定103例結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果對比分析

兩種培養(yǎng)基上的藥敏情況,經(jīng)統(tǒng)計學分析各種藥物均無顯著性差異(p＞0.05）。

2.5 幾種培養(yǎng)基價格的對比分析(藥敏按四種藥物計算）見表4。

表4 幾種培養(yǎng)基價格的對比

由表4可看出:應用固液雙相培養(yǎng)基進行結(jié)核菌培養(yǎng)、藥敏所需的成本與改良羅氏培養(yǎng)基相當,確遠遠低于液體培養(yǎng)基的價格。

3 討論

結(jié)核桿菌在雞蛋或含血清瓊脂等固體培養(yǎng)基上生長緩慢的關(guān)鍵、是標本經(jīng)酸或堿處理直接接種在培養(yǎng)基上后,至少需2-3天培養(yǎng)基才能緩沖堿,達到pH7.2左右。此外細菌細胞不能有效地吸收營養(yǎng)成分而導致細菌對數(shù)生長期延滯,而本研究設計固液雙相培養(yǎng)基pH為6.5-6.7接種氫氧化鈉與痰的混合液后,使pH改變至7.0-7.2。尤其是細菌細胞在液相培養(yǎng)基內(nèi)可使細菌浸泡在營養(yǎng)成分中以利于新陳代謝對數(shù)生長期提前。本研究基礎實驗證明,說明固液雙相培養(yǎng)基的優(yōu)越性。液體培養(yǎng)基陽性菌落呈白色顆粒狀,難以鑒別菌落特性,而固相生長的菌落則典型,易于判斷,且有利于藥敏試驗菌落的挑選。雙相培養(yǎng)基液相部分可達到快速培養(yǎng)的目的,固相可提供分枝桿菌典型菌落,體現(xiàn)了雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點[2]。從臨床陽性標本結(jié)果顯示雙相培養(yǎng)基平均生長時間比羅氏培養(yǎng)基快8.1天左右,尤其是雙相培養(yǎng)基生長結(jié)束時間在30天.而傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)基規(guī)定為8周,所以使用雙相培養(yǎng)基可使結(jié)核培養(yǎng)縮短1個月。

本研究雙相培養(yǎng)基用磷酸鹽調(diào)節(jié)pH6.5-6.7,痰標本經(jīng)2%氫氧化鈉處理后不中和、不離心直接接種,操作十分簡便,且固相培養(yǎng)基上生長的菌落典型,易于挑取,有利于藥敏實驗菌懸液的定量制作。其污染率與改良羅氏培養(yǎng)基的污染率無無顯著性差異,在改良羅氏培養(yǎng)基中,微量孔雀綠既可抑制雜菌的生長,又可對結(jié)核桿菌的生長有促進作用。在Middle brook 7H9的基礎上,羧芐青霉素C、兩性霉素B即可制備成結(jié)核菌素的選擇培養(yǎng)基,其目的主要是為了減少污染率,提高陽性率。

菌型鑒定采用PNB固液雙相培養(yǎng)基,在10天內(nèi)可達到初步篩選結(jié)核分枝桿菌的目的。

在藥敏方面,傳統(tǒng)的含藥羅氏培養(yǎng)基上存在抗結(jié)核藥物受熱失活和蛋白質(zhì)吸附兩個主要問題至今尚未解決,而固液雙相培養(yǎng)基的優(yōu)點在于不存在高蛋白組分對藥物的吸附作用,又無加熱凝固等造成藥物失活問題,因此在藥敏試驗方面有著顯著的優(yōu)越性。本實驗表明固液雙相培養(yǎng)基的藥敏結(jié)果與改良羅氏培養(yǎng)基無顯著性差異。藥敏試驗報告結(jié)果比羅氏培養(yǎng)基平均早8.8天,多數(shù)藥敏結(jié)果可在2周內(nèi)報告,對結(jié)核病的臨床治療有重要指導意義。

本研究結(jié)果證明固液雙相培養(yǎng)基有刺激結(jié)核桿菌生長的作用,尤其是其價格低廉,制作方便,操作簡單,適合于我國廣大基層醫(yī)院和結(jié)核病院應用,并有很高的應用價值。

[1]申建維,袁 瑋,李 娉,等.平菇雙相培養(yǎng)基用于結(jié)核桿菌培養(yǎng)的研究[J].中國防癆雜志,2001,23(4）:241.

[2]匡鐵吉,董 梅,張青霞,等.匡氏瓊脂培養(yǎng)基用于痰結(jié)核菌直接藥敏試驗的效果研究[J].中國檢驗醫(yī)學與臨床,2002,3(2）:54.