應用RNAi技術沉默survivin基因對肝癌細胞系BEL-7404生長的影響

廖 艷,袁晟光,廖維甲*,覃理靈,梅銘惠,陳 謙

(1.桂林市疾病預防控制中心,廣西桂林 541001;2.桂林醫學院附屬醫院肝膽外科研究室）

生存素(survivin）是近年來發現的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP）家族新成員,在多數惡性腫瘤組織中表達豐富,但在相應正常成人組織中低表達或不表達,這種選擇性表達特性使其成為惡性腫瘤診斷和治療的新靶點[1]。Zhu等[2]及筆者課題組前期研究也發現肝細胞癌(HCC）組織中存在survivin的高表達[3]。RNA干擾技術(RNA interfering,RNAi）是近年來迅速發展起來的生物技術,已成為基因功能研究以及基因治療的強有力工具[4,5]。RNAi技術在疾病的基因治療上具有光明的應用前景,如腫瘤以及病毒感染等。因此,我們利用siRNA建立起一種轉錄后沉默(PTGS）的小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA）來沉默肝癌細胞中survivin表達的方法,對腫瘤細胞生長的影響,為腫瘤的基因治療提供新的方法和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料肝癌細胞系BEL-7404為北京大學肝病研究所惠贈,E.coli菌為本實驗室保存;DEME、Trypsin-EDTA、G418、胎牛血清和卡鈉霉素購自GIB-CO公司;脂質體LipofectamineTM 2000和TRIzol購自Invitrogn公司;LB培養基、內切酶HindⅢ、BamHⅠ、TaqDNA聚合酶和DNA maker等酶購自華美生物工程公司;PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司;甲基噻唑藍(MTT）和二甲基亞砜(DMSO）購于Sigma公司;引物由上海生物工程公司合成;小鼠抗人Survivin單抗、羊抗小鼠IgG和DAB顯色試制盒購自福州邁新生物技術開發有限公司;質粒抽提試劑盒購自北京三博遠志生物技術公司。

1.2 設計合成pGenesil-1/Survivin載體的DNA片段pGenesil-1/survivin表達載體合成及細胞轉染參照Harborth等[6]的干涉 RNA設計原則,和survivin(NM_001168）編碼序列,并利用 BLAST進行查詢,確定并特異性設計合成2對survivin編碼的siRNA序列,目標基因序列為:GGACCACCGCATCTCTACA;設計合成siRNA干擾的目標基因序列:正義鏈(sense）的序列為 :5′-CACCGGACCACCGCATCTCTACATT CAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTG-3′,反義鏈(antisense）的序列為:

3′-GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGACGTGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTTGAGCT-5′;

設計合成siRNA干擾的陰性對照基因序列:sense序列為:

5′-AGCTTGTCGACAAAAAAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTCG-3′,antisense序列為:

3′-TGTCGACAAAAAAGACTTCAAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGCGCCTTATGAAGTCGGATC-5′。此互補序列為兩條反向重復序列,兩端分別帶有HindⅢ和BamHⅠ的酶切位點,便于與pGenesil-1載體連接。用T4DNA連接酶將survivin-siRNA與pGenesil-1定向連接后轉化E.coli菌,用含有卡拉霉素的選擇性LB固體培養基鋪平板37℃培養過夜,分別挑出單菌落37℃搖床培養過夜,抽提質粒DNA并進行序列分析。

1.3 細胞培養及siRNA轉染肝癌細胞系BEL-7404常規培養于含100 ml/L的胎牛血清,100 g/L青霉素,100 g/L的鏈霉素的DEME培養液中,培養條件為37℃,CO2的濃度為50 ml/L,定勤觀察細胞生長情況,每2 d用2.5 g/L的Trypsin-EDTA消化,進行轉代培養。將BEL-7404細胞轉入6孔板中培養,設空白組、脂質體組、siRNA陰性對照組、siRNA組等4組。待細胞融合達70%左右時,換為無血清培養液,并按LipofectamineTM2000脂質體的說明書以siRNA表達載體分別轉染BEL-7404細胞,同時設立不轉染載體的空白組和脂質體組。轉染48 h后,更換為含100ml/L的胎牛血清G418選擇培養基,繼續培養24 h,更換濃度為800 mg/L的G418選擇培養液進行篩選,培養3 d,更換濃度為200 mg/L的G418選擇培養基,每3 d更換一次選擇培養基;挑選單克隆細胞進行擴大培養;用TRIzol試劑盒提取細胞總RNA,部分用于免疫組化檢測。

1.4 實時定量PCR檢測survivin mRNA的表達按照TRIzol試劑盒方法操作,提取細胞總RNA溶于20 μ l DEPC水,經紫外分光光度儀定量,總RNA通過逆轉錄反應合成cDNA,進行PCR擴增。引物設計根據GenBank的相應cDNA序列,運用Primer Premier 5.0軟件設計survivin和β-Actin引物序列,并經Pubmed Blast對比核對,所設計的引物序列均具有較好的特異性。survivin引物設計為:上游:5'-ATGGGTGCCCCGACGTTG-3',下游:5'-AGAGGCCTCAATCCATGG-3',擴增產物的大小為:436 bp。同時以 β-actin:上游 :5′-TCAC2CCACACTGTGCCCATCTACGA-3′,下游:5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′為反應內參照(擴增片段的大小為:400 bp）。反應體系如下 :總體積 20 μ l,SYBR Premix Ex Taq 10 μ l,引物(10 μ mol/L）各 0.4 μ l,DNA 2 μ l,ddH2O 7.2 μ l,混勻試劑,離心后放入PCR儀中進行擴增反應。所有實驗均重復3次。對照組和實驗組基因的表達水平按以下方法進行計算。Surviving-Δ Ct=平均survivin-Ct-平 均 β-actin-Ct;Surviving-Δ Δ Ct=surviving-Δ Ct-實驗組-surviving-Δ Ct空白組;空白組和實驗組中的待測基因的倍數關系用2-survivinΔΔCt來計算[7]。

1.5 免疫組織化學檢測先將培養細胞用PBS洗3次,冷丙酮固定 10 min后,1%TritonX100處理 20 min。3%過氧化氫溶液浸泡10 min,正常小牛血清,37℃孵育20 min。加入一抗,4℃冰箱孵育過夜,加入二抗,37℃30 min;DAB顯色,鏡下控制;蘇木素復染1-2 min。survivin蛋白陽性染色呈棕黃色,主要定位于細胞質。光鏡下計數500個細胞中survivin蛋白陽性染色的細胞數,計算survivin蛋白陽性細胞率。

1.6 MTT法檢測survivin-siRNA轉染對BEL-7404細胞影響取各組穩定轉染和未轉染BEL-7404細胞,配制單個細胞懸液,以每孔2×105細胞接種于96孔培養板,每組3孔,每孔設3個復孔,在培養24、48、72 h 后每孔加入 5 g/L 的MTT 溶液 20 μ l,37℃溫育 4 h,棄上清 ,每孔加入 DMSO 100 μ l震蕩10 min,酶標儀下450 nm波長測OD值,根據公式計算細胞抑制率:細胞抑制率=(空白組OD值-實驗組OD值）/空白組OD值×100%。

1.7 統計學處理

采用SPSS11.0統計軟件進行統計學處理,計量資料均采用 ˉx±s表示,兩組間均數比較采用t檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SiRNA轉染后對細胞株BEL-7404細胞生物學特性的影響

經siRNA轉染24 h后,BEL-7404細胞形態變圓、細胞體積大小不等、漂浮細胞增多等凋亡改變,而siRNA陰性對照組、脂質體轉染組和空白組僅有少量細胞出現漂浮,大部分細胞形態基本正常,貼壁生長良好。

2.2 RT-PCR檢測survivin mRNA的表達

實時定量PCR檢測survivin轉錄水平顯示:BEL-7404細胞經特異性siRNA作用后,與空白組相比較survivin基因的表達受抑制其Ct值由34.2降低到22.8。PCR產物電泳圖如圖1。

Fig 1 Survivin siRNA expression levels after transfection

2.3 免疫組化檢測結果

survivin-siRNA轉染肝癌細胞株BEL-7404細胞時抑制survivin在細胞中表達。siRNA組與空白組細胞相比,siRNA組細胞中的survivin蛋白陽性細胞率降低,由66.2%降為47.4%。免疫組化檢測結果如下(圖2）。

Fig 2 The expression of survivin protein in BEL-7404 cells after siRNA transfection(×400）

2.4 MTT法細胞檢測結果

MTT法檢測結果顯示,Survivin-siRNA轉染對BEL-7404細胞有明顯的抑制作用,其它組間細胞的增殖情況無顯著性差異(表1）。

Table 1 MTT assay inhibition of BEL-7404 cells by survivin siRNA(±s,%）

Table 1 MTT assay inhibition of BEL-7404 cells by survivin siRNA(±s,%）

※P＜0.01 vs blank group

24 h(OD值 抑制率） 48 h(OD值 抑制率） 72 h(OD值 抑制率）空白組 0.652±0.015 0.581±0.018 0.469±0.015脂質體組 0.670±0.021 0.572±0.019 0.445±0.013 siRNA 對照組 0.628±0.015 0.587±0.015 0.458±0.020 siRNA 組 0.360±0.019※ 44.8% 0.274±0.016※ 52.8% 0.263±0.018※ 48.1%

3 討論

RNAi能高度特異性地降解與其序列高度互補的靶mRNA,而對其它基因的表達沒有明顯影響,這使得它在醫學科學,特別對腫瘤基因治療中具有極高研究價值。Survivin作為一種新的凋亡抑制因子,在包括HCC在內的許多腫瘤中均高表達,因而有可能作為腫瘤治療的一個特異的攻擊靶點,越來越受到國內外學者們的廣泛關注。有研究報道,應用RNAi技術對人肝癌細胞株SMMC-7721[8]、肺腺癌細胞系A549[9]等干擾Survivin基因的表達,均能有效地促進瘤細胞的凋亡。Moriyama等[10]也設計siRNA對survivin基因干擾,發現誘導黑色素瘤細胞明顯凋亡,認為survivin是治療黑色素瘤的理想靶點。

本研究通過survivin-siRNA轉染高表達survivin基因的肝癌細胞系BEL-7404后,來檢測其對BEL-7404細胞的影響,并評價沉默survivin基因表達的抑制作用。MTT法對細胞活性檢測顯示,siRNA組細胞生長受抑,siRNA轉染組的OD值明顯低于其他各組,其抑制率與空白組相比(P＜0.01）;RT-PCR檢測顯示,BEL-7404細胞經特異性siRNA作用后,與空白組相比較survivin基因的表達受抑制,其Ct值由34.2降低到22.8;免疫組化檢測亦表明:survivinsiRNA轉染肝癌細胞株BEL-7404細胞能有效地抑制survivin在細胞中蛋白表達,siRNA轉染組與空白組細胞相比,siRNA組細胞中的survivin蛋白陽性細胞率降低,由66.2%降為47.4%。表明survivin-siRNA轉染具有特異性抑制目的基因survivin的作用,提示RNAi在肝癌細胞系BEL-7404中可將survivin基因沉默。

利用siRNA建立的RNA干擾肝癌細胞系中survivin表達的方法具有較高的特異性和可控性,其抑制目的基因的作用遠高于其他基因阻斷技術。但從本研究也發現siRNA特異性轉染對抑制細胞生長有時間衰減性,轉染后 48 h后 siRNA組抑制率達52.8%,隨著時間的延長至 72 h時,抑制率為48.1%。出現這種情況可能與許多的影響因素有關,如選擇不同的siRNA載體,其轉染成功率不一,LipofectamineTM 2000脂質體對細胞的毒性,以及RNAi技術的生物安全性等。隨著RNAi機制的深入研究和RNAi技術的不斷完善,它將在防治腫瘤領域展示出廣闊的應用前景。進一步闡明特異性Survivin-siRNA對肝癌細胞增殖和凋亡作用的分子機制,以期為防治肝癌提供理想的方法和途徑,有著十分重要的理論和實踐意義。

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[3]廖維甲,覃理靈,梅銘惠.凋亡抑制因子 survivin在肝細胞肝癌的表達及臨床意義[J].現代腫瘤醫學雜志,2007,15(8）:1137.

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