茶多糖的提取及分離純化研究進(jìn)展

崔宏春 余繼忠* 黃海濤 周鐵鋒 鄭旭霞 師大亮 郭敏明 江和源 江用文

(1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院茶葉研究所 杭州 310024;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 杭州 310008)

茶葉起源于中國(guó)，是中國(guó)古代文獻(xiàn)記載中被提及最早的天然藥物之一。茶葉最早是作為一些有毒草藥的解毒劑，在中國(guó)和日本民間曾有常飲用粗老茶來(lái)治療糖尿病的經(jīng)驗(yàn)[1-3]。據(jù)大量文獻(xiàn)報(bào)道，茶葉具有廣泛的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其生物活性與茶葉中所含的活性成分密切相關(guān)。

茶多糖是繼茶多酚后從茶葉中提取出來(lái)的、具有多種生物活性、組分復(fù)雜的茶葉天然活性物質(zhì)。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，茶多糖的較突出功效是降血糖、降血脂[4-5]，并且在防治糖尿病[6]、抗凝血、防血栓形成[7]，保護(hù)血相和增強(qiáng)人體非特異性免疫能力等方面也具有明顯功效[8-10]，是一種極具應(yīng)用和開發(fā)前景的天然產(chǎn)物，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域。隨著對(duì)多糖研究的日益深入，特別是自發(fā)現(xiàn)茶葉降血糖有效成分主要是水溶性組分中的多糖復(fù)合物以后，茶多糖的提取、分離純化、分析檢測(cè)等方面研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也對(duì)其進(jìn)行了較為廣泛而深入的研究，本文就近年來(lái)茶多糖的提取及分離純化研究進(jìn)展作以綜述。

1 茶多糖的提取

茶多糖在生理pH條件下帶負(fù)電荷，主要為水溶性，且易溶于熱水，但不溶于高濃度的有機(jī)溶劑，熱穩(wěn)定性差，高溫、過(guò)酸或偏堿的條件均會(huì)使其部分降解而喪失生物活性。因此，茶多糖的提取應(yīng)避免在強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液中進(jìn)行，否則極易促使茶多糖的糖苷鍵斷裂及發(fā)生構(gòu)象變化，從而降低甚至失去生物活性。茶多糖提取的方法有水提法、酸提法、堿提法，以及一些輔助提取法，如微波輔助提取法、酶輔助提取法和超聲波輔助提取法等[11-15]。酸提法和堿提法對(duì)提取條件要求較高，因此這兩種提取法及相應(yīng)的輔助提取法應(yīng)用相對(duì)較少。當(dāng)需要使用這兩種方法提取茶多糖時(shí)，特別應(yīng)該注意的是，采用稀酸提取，時(shí)間宜短，溫度不宜過(guò)高;采用稀堿提取，應(yīng)在氮?dú)庵羞M(jìn)行，防止多糖降解。目前，應(yīng)用較多的茶多糖提取方法主要是水提法，本文著重對(duì)茶多糖的水浸提法作以綜述。

1.1 水浸提法

水提取法因操作簡(jiǎn)便、實(shí)用性強(qiáng)，而被廣泛應(yīng)用，并且其輔助提取法也被廣大學(xué)者應(yīng)用與研究。茶多糖的水提取法，通常是將茶葉磨碎，然后采用有機(jī)溶劑浸泡法，脫除部分小分子色素，再用水浸提，或者不使用有機(jī)溶劑，直接使用水浸提。

黃杰等[19]研究了浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比對(duì)茶多糖得率、茶多糖含量及蛋白質(zhì)含量的影響，得出較佳的茶多糖提取工藝，浸提溫度宜在55℃，浸提時(shí)間宜為3 h，料液比達(dá)到1∶25即可。王黎明[20]采用二次響應(yīng)面分析法，得出水提取茶多糖的較佳提取條件為溫度70℃，浸提時(shí)間1.5 h，料液比為1∶10，浸提3次。周小玲[21]也采用二次響應(yīng)面分析法，得出較佳的提取條件為提取溫度80℃，浸提時(shí)間1.5 h，料水比1∶20。綜合前人研究成果，茶多糖常用的水提工藝參數(shù)為，95%乙醇浸泡(可選的工藝)，55℃ ～100℃水浸提，浸提時(shí)間1 h～3 h，料液比 1∶10 ～1∶30[16-18]。

1.2 茶多糖提取新技術(shù)

隨著化工儀器和食品加工技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的新技術(shù)和新儀器開始應(yīng)用到茶多糖的提取中。酶法輔助提取、微波輔助提取及超聲波輔助提取是近年來(lái)應(yīng)用在茶多糖提取的新技術(shù)，與傳統(tǒng)的水提法相比，較大的提高了茶多糖的得率，提高了資源利用率。

酶工程技術(shù)是用于天然植物有效成分提取的一項(xiàng)新型生物工程技術(shù)，選用合適的酶，可在常溫常壓條件下即可將植物組織分解，加速有效成分的釋放，從而提高得率。在茶多糖酶法輔助提取中，應(yīng)用較多的酶為蛋白酶、果膠酶、纖維素酶，除此外還有應(yīng)用茶葉水解酶、胰酶以及一些復(fù)合酶。王元鳳等[22]將復(fù)合酶和果膠酶用于茶多糖的提取，使得茶葉細(xì)胞壁破裂，促進(jìn)多糖的溶出，使茶多糖提取率達(dá)到了2.21%。周小玲等[23]采用果膠酶、胰蛋白酶和復(fù)合酶提取嶗山粗老綠茶中的茶多糖，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶提取法的提取率最高，但果膠酶法的總糖含量最高。而郭艷紅等[24]研究茶葉水解酶、戊聚糖酶、纖維素酶和葡聚糖酶酶法輔助提取茶多糖得率，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%的茶葉水解酶，在 pH 值 5.5、溫度 48℃的條件下，茶多糖含量最高，得率為2.01%。

微波技術(shù)應(yīng)用于茶多糖提取，既可以提高茶多糖得率，又可以降低成本，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。張忠等[25]利用正交試驗(yàn)研究微波輔助提取茶籽多糖的提取條件，得出最佳提取條件為。浸提功率400W，固液比1:30，pH為5，浸提時(shí)間30S。聶少平等[26]研究得出微波輔助提取法與酶法輔助提取法、水提取法相比，具有時(shí)間短、得率高的優(yōu)點(diǎn)，是茶多糖提取的一種優(yōu)選方法。此外，汪興平等[27]研究微波輔助提取法對(duì)茶多糖、咖啡堿結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)其對(duì)茶多糖和咖啡堿制品的化學(xué)結(jié)構(gòu)并無(wú)影響。

超聲波輔助提取主要是利用超聲波在液體中的空化作用加速植物細(xì)胞破碎，使有效成份浸出提取，具有高效、適用性廣、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[28]，為植物功能成分提取提供了一種快速、高效的新方法。鞏發(fā)永等[29]利用正交試驗(yàn)，研究超聲波輔助提取邊茶中茶多糖的提取條件，得出最佳提取條件為超聲波功率360 W、料液比1∶50、浸提時(shí)間35 min、浸提溫度45℃。而安衛(wèi)征等[30]也采用正交試驗(yàn)研究超聲波輔助提取普洱茶多糖的最佳提取條件，發(fā)現(xiàn)功率800 W，料液比1∶50，時(shí)間25 min，多糖得率較高。兩者的超聲波輔助提取最佳條件差別較大，可能是后者正交試驗(yàn)時(shí)沒有把溫度作為一個(gè)因素，另一方面是兩者用的原料不同。

2 茶多糖的分離純化

通過(guò)水提法、酸提法、堿提法等方法提取得到的只是茶葉粗多糖，為了得到純度更高的茶多糖，必須去除與其分子質(zhì)量相差不大的水溶性物質(zhì)、色素、脂類、低聚糖等雜質(zhì)。粗多糖分離純化的一般步驟為“脫蛋白→脫色→分級(jí)，或者分離(初步分級(jí))→脫蛋白→脫色→進(jìn)一步分級(jí)”，并且脫蛋白和脫色順序可以顛倒，組分分級(jí)可以多種方法聯(lián)合應(yīng)用。

2.1 脫蛋白

粗多糖中含有大量蛋白等雜質(zhì)，汪東風(fēng)[32]和李布青[31]等證實(shí)茶多糖是一類與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的酸性多糖或一種酸性糖蛋白，而且茶多糖中游離蛋白質(zhì)的堿性氨基酸會(huì)與多糖鏈上的酸性基團(tuán)產(chǎn)生靜電結(jié)合，使蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合更緊密。一般常用的脫蛋白法有Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯乙酸法。Sevag法的條件較為溫和，可避免多糖的降解，缺點(diǎn)是一次只能除去少量蛋白質(zhì)，需要多次反復(fù)才能去除盡，多糖常因多次除蛋白處理而損失。三氟三氯乙烷法效率較高，但因其易揮發(fā)，不宜大量應(yīng)用。三氯乙酸法脫蛋白效果較好，但此法較為劇烈，會(huì)引起某些多糖的降解，使得率降低，并且據(jù)報(bào)道該法還會(huì)影響茶多糖的活性。但因其操作簡(jiǎn)便、適用性較強(qiáng)，目前此法在茶多糖脫蛋白中應(yīng)用較廣。

2.2 脫色

茶葉中含有的色素種類較多，但對(duì)茶多糖提取分離影響較大的主要是多酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)極易氧化，并且氧化后顏色加深。色素物質(zhì)加重了茶多糖產(chǎn)品的色澤，嚴(yán)重影響著茶多糖的結(jié)構(gòu)分析、作用機(jī)理及構(gòu)效關(guān)系等研究，因此對(duì)提取的粗茶糖必須進(jìn)行脫色處理。常用的脫色方法主要有物理吸附法和氧化法，其中物理吸附法包括活性炭脫色法和大孔吸附樹脂法，而氧化法包括雙氧水脫色法以及離子交換法中的纖維素柱層析脫色。

活性炭脫色法主要原理是依靠范德華力將色素吸附到活性炭表面，活性炭的顆粒愈小，其表面積愈大，吸附能力愈強(qiáng)，粗茶多糖的脫色效果愈好。但活性炭脫色樣品損失較大，對(duì)于從動(dòng)植物中提取的天然多糖，由于本身含量量就不高，所以一般不用活性炭脫色法處理[33]。大孔吸附樹脂法脫色效果雖好，但操作繁瑣，樹脂易污染，成本較高。

纖維素柱層析脫色法是近年新發(fā)展起來(lái)的一種脫色方法，不僅具有脫色作用，而且可以去除茶多糖粗提物中的殘余茶多酚，對(duì)茶多糖進(jìn)行初步分級(jí)，但其適合于處理量小、黏性小、色素含量較小的體系，否則易造成纖維素填料污染，再生困難，并且纖維素填料成本較高，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。纖維素柱層析一般選用DEAE做交換劑，適合分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖，吸附力隨多糖分子中酸性基團(tuán)的增加而增加。江和源等[34]采用DEAE-52纖維素對(duì)茶多糖進(jìn)行脫色分級(jí)純化，得到TPS1-H2O、TPS1-0.25和TPS1-0.40三個(gè)組分的茶多糖，對(duì)應(yīng)洗脫液分別為 H2O、0.25 mol/L NaCl和 0.40 mol/L NaCl。

雙氧水脫色法的脫色原理是依賴雙氧水在水溶液中電離出的過(guò)氧化氫根離子HO2－去進(jìn)攻色素的結(jié)果。在酸性和堿性介質(zhì)中，能起漂白作用的HO－2離子濃度很低，漂白作用很差，加入弱堿后，電離度增大，即雙氧水被活化，漂白作用增強(qiáng)，分解速度加快。分析個(gè)中原因，主要是因?yàn)樵诩尤肴鯄A的條件下，雙氧水容易分解形成HO2－，而 HO2－是一種親核試劑，易引發(fā)過(guò)氧化氫分解，產(chǎn)生游離基，游離基一旦與茶葉中的色素發(fā)生作用，便可使之脫色。筆者[35]曾采用正交試驗(yàn)研究茶多糖雙氧水脫色的實(shí)驗(yàn)條件，綜合脫色效果及多糖得率得出最佳條件為5 ml H2O2、溫度 30℃、pH 7.0、脫色 5 h。

2.3 茶多糖組分分級(jí)

2.3.1 初步分級(jí) 粗多糖組分初步分級(jí)的方法有分步沉淀法，季胺鹽沉淀法，超濾法。分步沉淀法是根據(jù)不同性質(zhì)以及不同分子量的多糖在不同濃度的乙醇或丙酮中的溶解度不同，從而分離得到某一性質(zhì)或某一分子量的多糖.此方法適宜于分離溶解度相差較大的多糖。季胺鹽沉淀法的主要原理是利用長(zhǎng)鏈季胺鹽能與酸性多糖形成水不溶性化合物，從而分離得到酸性及中性多糖，但須嚴(yán)格控制混合物的pH值小于8，以及無(wú)硼砂存在，否則中性多糖也會(huì)沉淀出來(lái)，且酸性強(qiáng)或分子量大的酸性多糖首先沉淀出來(lái)。常用的季胺鹽是十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)及其堿(CTA－OH)和十六烷基吡(CPC)。楊其林等[36]利用正交試驗(yàn)得出CTAB沉淀茶多糖的最佳工藝條件為:離心時(shí)間12 min，CTAB濃度0.05 g/ml，加入量 25 ml，沉淀時(shí)間 6 h。

超濾法是利用不同孔徑的超濾膜允許不同分子量的物質(zhì)通過(guò)，使樣品溶液通過(guò)已知膜孔徑的超濾膜從而分離得到茶多糖組分。該方法既避免了制備過(guò)程中各成分的互相干擾，提高了茶多糖產(chǎn)品的純度，又節(jié)約了處理成本，而且整個(gè)過(guò)程不引入有毒的有機(jī)溶劑，設(shè)備操作簡(jiǎn)便，極具工業(yè)化應(yīng)用前景[37]。1991年時(shí)，Kenichi I等[38]采用超濾法制備得到純化的茶多糖組分。寇小紅等[39]采用膜過(guò)濾法研究經(jīng)過(guò)0.2 μm孔徑膜處理后的茶湯濾液，再依次經(jīng)過(guò)150 kD、20 kD、6 kD的膜組件進(jìn)行分級(jí)和濃縮，結(jié)果表明，超濾膜分離處理對(duì)于茶多糖的分離純化效果明顯。尹軍峰等[40]通過(guò)對(duì)不同孔徑膜的篩選試驗(yàn)，確定50 K分子量的膜為富集茶多糖最好的膜。

2.3.2 精細(xì)分級(jí) 粗茶多糖經(jīng)過(guò)脫蛋白、脫色以及初步分級(jí)處理，大部分雜質(zhì)已經(jīng)除去了。但因茶多糖并不是均一多糖，而是由多種分子量的組分組成的，若要進(jìn)一步分析其組成、相對(duì)分子量、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效等，還需要對(duì)茶多糖進(jìn)一步精細(xì)純化分級(jí)。多糖進(jìn)一步純化分級(jí)的方法較多，主要有制備性高效液相色譜法、制備性區(qū)帶電泳法、親和層析法、離子交換劑柱層析法和凝膠柱層析法等。比較常用的茶多糖精細(xì)分級(jí)純化處理方法主要是高效液相色譜法和柱層析法，本文著重對(duì)茶多糖柱層析純化法作以綜述。

常用的茶多糖柱層析純化法有纖維素陰離子交換柱層析法和凝膠柱層析法。纖維素柱層析法一般用DEAE做交換劑，適合分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖，吸附力隨多糖分子中酸性基團(tuán)的增加而增加。凝膠柱層析法是利用凝膠的分子篩作用，根據(jù)多糖分子大小的不同進(jìn)行分離。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(Sephadex)、瓊脂糖凝膠(Sepharose)以及丙稀葡聚糖凝膠(Sephacryl)。這三種凝膠都有不同的分子量范圍，適合于分離具有不同分子量的樣品。這兩種柱層析都具有脫色和分級(jí)兩種作用，其中纖維素陰離子交換劑柱層析脫色效果較好，凝膠柱層析分級(jí)效果較好。在多糖分級(jí)純化過(guò)程中，為得到到茶多糖均一組分，一般先用纖維素陰離子交換柱層析對(duì)茶多糖進(jìn)行初步脫色分級(jí)，所得組分再用凝膠柱層析進(jìn)一步分級(jí)純化。寇小紅等[41]對(duì)經(jīng)過(guò)150 kD、20 kD、6 kD超濾膜處理得到的茶多糖的濾液和截留液，分別用DEAE-52纖維素離子交換層析和丙烯葡聚糖凝膠Sephacryl S-300柱層析系統(tǒng)進(jìn)行再分離和純化，共得到了20多個(gè)茶多糖的分級(jí)組分。王元鳳[42]用DEAE Sepharose FF柱層析系統(tǒng)把經(jīng)過(guò)D315樹脂脫色分離得到的多糖樣品NTPS和ATPS，再純化分級(jí)為四個(gè)組分，其中NTPS1、ATPS2、ATPS4為均一多糖。

3 展望

近20年來(lái)，由于生物化學(xué)、分析化學(xué)、植物學(xué)、醫(yī)學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展和交叉發(fā)展，人們對(duì)多糖及其復(fù)合物的提取分離、結(jié)構(gòu)、生物活性等有了越來(lái)越深入的認(rèn)識(shí)。茶多糖作為茶葉中功能成分中的一種生物活性物質(zhì)，具有多種藥理作用，其生產(chǎn)工藝已得到比較深入的研究，并且由于其制備的原料多為粗老茶葉，資源較豐富且價(jià)格低廉，其應(yīng)用和開發(fā)前景非常廣闊。

茶多糖的結(jié)構(gòu)分析、藥理作用、結(jié)構(gòu)及分子修飾等研究，都依賴于茶多糖的提取及分離純化技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步。目前，高純度茶多糖的制備在實(shí)驗(yàn)室里已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)，但由于原料不同及提取分離純化技術(shù)的不同，所得的高純度茶多糖組分、結(jié)構(gòu)等有所差別，這在一定程度上制約了茶多糖的結(jié)構(gòu)解析、藥用機(jī)理等研究。此外，在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中，茶多糖提取和分離純化工藝研究尚不夠深入，如工藝流程繁瑣、生產(chǎn)成本過(guò)高、生產(chǎn)設(shè)備落后等原因，造成目前市場(chǎng)上銷售的茶多糖產(chǎn)品純度較低，產(chǎn)品利潤(rùn)空間小，且嚴(yán)重影響茶多糖終端產(chǎn)品的開發(fā)。另外，在制備茶多糖的過(guò)程中，仍存在有大量使用機(jī)溶劑的問(wèn)題，使茶多糖產(chǎn)品存在質(zhì)量安全隱患，成為制約茶多糖相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)的又一個(gè)瓶頸。新技術(shù)的引進(jìn)與工藝參數(shù)的成熟化，多種提取技術(shù)和分離純化方法的搭配優(yōu)化，與茶多酚制備技術(shù)、咖啡堿制備技術(shù)等技術(shù)的結(jié)合與綜合運(yùn)用，綠色環(huán)保與低耗能低成本制備技術(shù)的研究等，這些將是茶多糖提取及分離純化技術(shù)的未來(lái)研究熱點(diǎn)與發(fā)展趨勢(shì)。

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