腫瘤基因治療的研究進展

曹康，鄒毅，彭延娟

（1.成都醫學院病原生物學教研室，四川 成都 610083；2.廣東省食品藥品監督管理局審評認證中心，廣東 廣州 510080；3.成都醫學院藥理學教研室，四川 成都 610083）

腫瘤是危害人類健康的重大疾病之一。目前的治療癌癥的手段，比如化療、放療、手術治療等等，可能會降低機體的免疫力，所以不能滿意地達到限制腫瘤生長和擴散的效果［1］。而研究表明，腫瘤的發生、發展與基因的突變有關，可以說腫瘤是一種基因疾病。在各種物理和化學因素的作用下，原先正常的細胞中某些基因發生改變，比如原癌基因或是抑癌基因（tumor suppressor gene）突變導致細胞不停增殖，機體無法控制而導致腫瘤發生。此外，腫瘤細胞在生長過程中也會不斷發生新的突變，這些突變可能導致腫瘤細胞對化療藥物失去敏感性。因此，迫切需要尋找新的途徑來治療腫瘤。

本世紀末，隨著分子生物學的發展，隨著DNA重組技術的成熟，基因治療成為了一種新的治療手段。基因治療是目前腫瘤研究中一項重要的突破，基因治療能刺激人體免疫力，來幫助機體識別腫瘤細胞并清除腫瘤細胞。基因治療的原理是將外源性基因片段引入腫瘤細胞內使得腫瘤細胞中異常的基因得到控制，從而達到控制腫瘤的目的。腫瘤的基因治療包括抑制癌基因和腫瘤多藥耐藥基因的表達、抑制血管生成、激活腫瘤抑制基因等等。近年來，隨著基因治療手段的不斷發展，腫瘤基因治療獲得了長足的進步，逐漸成熟。很多腫瘤基因治療的研究已經獲得批準進入臨床試驗的階段。目前，腫瘤基因治療是腫瘤研究中非常有前景的領域之一。本文就腫瘤基因治療常用的方法及載體等進行了綜述。

1 腫瘤基因治療常用的方式

1.1 導入抑癌基因

抑癌基因是指正常細胞本身就存在的一群基因，它們能夠抑制細胞發生突變和向腫瘤發展。抑癌基因發生了突變，失去了對細胞生長的抑制作用，可以導致腫瘤的發生。細胞的DNA損傷可導致細胞DNA的突變，抑癌基因所編碼的蛋白質就可以激活細胞凋亡的信號通路，使損傷的細胞發生凋亡。如果抑癌基因失活，那么DNA突變的細胞可以繼續增殖從而導致癌變。研究發現，很多腫瘤患者都存在抑癌基因的失活，所以抑癌基因的失活與腫瘤的發生發展有著密切的關系。一種有效的方法是將抑癌基因導入腫瘤細胞，讓抑癌基因在腫瘤細胞中表達、恢復細胞的正常生長表型、控制腫瘤細胞的生長速度、誘導腫瘤細胞出現凋亡，以達到治療腫瘤的目的。現階段研究比較多的抑癌基因有p53、APC、p16、RB、DCC基因等，其中以p53基因的應用最常見，很多以p53基因為靶點的治療方案已進入臨床試驗或已經被批準用于臨床。

p53基因是腫瘤基因治療中最為常見的抑癌基因靶點，目前對p53這種抑癌基因研究最為深入。p53基因突變或者缺失是導致腫瘤發生的一個非常重要的因素，p53基因的突變會使它失去抑制腫瘤的功能，人類很多腫瘤中都有P53的突變。通過分子克隆技術將野生型p53基因轉入到腫瘤的基因組，用以替換腫瘤細胞中已經發生突變的p53基因，到達控制腫瘤生長，促進腫瘤凋亡。很多的體外和體內實驗都表明，在腫瘤細胞中引入p53基因可以抑制腫瘤細胞的生長，促進腫瘤的凋亡，效果比較明顯。不過，單一的p53基因治療腫瘤的臨床試驗雖然已獲得較好效果。為了加強療效可以將p53基因治療聯合其他療法，比如化療和放療，或者聯合細胞因子的基因治療。使用p53基因的重組腺病毒（Adp53）對喉癌、肺癌、神經膠質瘤、乳腺癌和卵巢癌的治療都有較好的效果，可以腫瘤體積縮小、腫瘤壞死和腫瘤細胞凋亡等［2－5］。

1.2 抑制癌基因的表達

癌基因是一類在正常細胞基因組中就存在的基因。它是維持機體正常生命活動所必須的基因，它的突變可能會導致細胞向惡性腫瘤轉化。癌基因有其正常的生物學功能，它可以刺激細胞的生長和發育。在正常情況下，這類癌基因并不表達，或其表達水平很低，不足以引起細胞的病變。如果癌基因發生突變，會導致細胞的生長速度失去控制，無節制地促使細胞生長，保護這些細胞免于死亡，導致腫瘤的發生。現在可以通過使用分子生物學的技術將重組質粒或者病毒引入腫瘤細胞，表達出癌基因的反義RNA、或通過RNA干擾（RNAi）技術，以達到抑制癌基因表達的目的。目前癌基因治療常見的靶點有RAS、survivin、c－myc等。這些基因在人類許多惡性腫瘤組織中都存在，是很有代表性的腫瘤基因［6－8］。

Survivin是一種新發現的抗凋亡基因，只在腫瘤組織中表達，而在正常的組織中不表達。其與腫瘤細胞的增殖、轉移、耐藥、復發等密切相關，目前認為Survivin是腫瘤治療的一個理想靶點。近來有很多研究，使用Survivin的反義核苷酸及用RNAi的方法抑制Survivin的表達取得了良好的效果［9，10］。

1.3 自殺基因治療

自殺基因又叫藥物敏感基因，當在腫瘤細胞中導入自殺基因后，自殺基因編碼的酶可以將對細胞無毒性的前體藥物代謝轉化成高濃度的毒性物質導致細胞死亡。自殺基因治療方法的另一個好處是旁觀者效應（bystander effect，BE），即不僅殺死已經導入自殺基因的腫瘤細胞，而且還可以殺死其周邊的腫瘤細胞。其機制是通過血管或者細胞間的縫隙，將代謝出的毒性產物從導入自殺基因的腫瘤細胞中擴散到鄰近的腫瘤組織，從而導致鄰近腫瘤組織的凋亡［12］。

目前常用的自殺基因有大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因、單純皰疹病毒胸苷激酶基因、水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶基因、細胞色素氧化酶P450基因等。細胞色素氧化酶P450能將環磷酰胺轉化為磷酸胺氮芥從而發揮抗腫瘤的作用［11］。單純皰疹病毒胸苷激酶基因能將無毒的丙氧鳥苷磷酸化，轉化為有毒的丙氧鳥苷三磷酸。有研究者使用單純皰疹病毒胸苷激酶基因作為靶點進行了多次臨床實驗，并取得了良好的效果［12，13］。

1.4 抑制血管生成

腫瘤的生長與轉移需要足夠的血液供應來提供營養物質和氧氣。如果能干擾腫瘤血管生成就有可能控制腫瘤的生長，使腫瘤出現壞死、凋亡、萎縮。而腫瘤的血管生成要受到促血管生成和抑制血管生成的各種因子的共同調控，通過阻斷促血管生長因子的表達或增強血管生長抑制因子的表達都可達到控制腫瘤血管生成的目的。內皮抑素（endostatin）和血管抑素（angiostatin）是腫瘤基因治療中比較常見和有效的抑制血管生成的分子。內皮抑素和血管抑素能抑制血管內皮細胞的增殖，導致內皮細胞出現凋亡，從而抑制腫瘤血管的生成。目前有大量的報道證明內皮抑素和血管抑素基因治療可以用于治療腎癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、結腸癌，能有效抑制腫瘤血管生成及控制腫瘤的生長［14－16］。

1.5 針對一些細胞因子的基因治療

腫瘤的發生和發展與機體免疫系統對癌細胞的免疫耐受密切相關。原因可能是因為癌細胞的抗原性不強而不能刺激機體的免疫應答，或者是因為抗原遞呈細胞不能提供足夠的共刺激信號，或者是因為機體細胞因子分泌不足等原因。細胞因子在腫瘤生長過程中起了重要作用。某些細胞因子的釋放，可以抑制腫瘤的發生與發展；而另一些細胞因子可以促進瘤細胞生長與增殖，加速腫瘤浸潤和轉移。可以將某些細胞因子的基因導入機體免疫活性細胞（如DC、TIL、LAK、細胞毒淋巴細胞和巨噬細胞細胞等）中來加強免疫系統對腫瘤細胞的識別和免疫反應能力。也可通過在腫瘤細胞中導入細胞因子受體基因的方法，讓腫瘤細胞表面的細胞因子受體表達增加，增強機體免疫系統對腫瘤細胞的識別和免疫殺死作用。目前的報道表明，如白細胞介素（IL）－1、IL－12、IL－3、IL－24、干擾素（IFN）－γ還有各種趨化因子等許多細胞因子都能增強機體對腫瘤的免疫能力［17－20］。

1.6 針對耐藥基因的治療

腫瘤細胞對化療藥物耐藥是一個非常棘手的問題。有些腫瘤細胞對多種化學藥物具有耐藥性，化療藥物難以將其殺死，加大化療藥物使用劑量能將腫瘤消滅，但還有可能殺傷正常細胞從而出現副作用。耐藥基因的存在是腫瘤細胞對化療藥物耐藥的一個重要原因。耐藥基因也叫化療保護性基因，目前研究最多的是多藥耐藥基因（multidrug resistance，MDR）。它可以將進入細胞內的藥物主動泵出細胞外，從而使腫瘤細胞免受化療藥物的殺傷。一方面，可以使用反義RNA技術或者RNAi技術，以抑制腫瘤細胞的多藥耐藥基因，從而逆轉腫瘤細胞對化療耐藥性；另一方面，也可以通過向正常組織細胞導入耐藥基因，以減輕化療藥物對正常組織的毒性作用，從而提高化療的效果。目前有不少以多藥耐藥基因為靶點來治療腫瘤的報道［21－23］。

1.7 腫瘤DNA疫苗

疫苗發展經過了3代，病原體的滅活疫苗和減毒活疫苗是第一代疫苗，亞單位疫苗是第二代疫苗，DNA疫苗是第三代疫苗。DNA疫苗是一項新的疫苗技術，出現于上世紀九十年代。研究發現直接肌肉和皮下注射流感病毒的裸DNA，可以使小鼠能出現細胞免疫和體液免疫，從而發明DNA疫苗［24］。近些年來，隨著腫瘤基因的研究取得了非常大的進展，腫瘤的DNA疫苗也成為目前腫瘤基因治療的一個重要手段。DNA疫苗的基本原理是：當在動物體內注入編碼某種抗原的外源基因后，在動物細胞內的外源基因會表達出相應的蛋白質，動物體內的蛋白酶水解酶會將這些蛋白質分解成8～12氨基酸的多肽。這些多肽一部分被轉運到內質網，在內質網與組織相容性復合物（MHC）－Ⅰ類分子結合，從而誘導CD8＋CTL的生成，出現細胞毒性T淋巴反應（CTL）。另外一部分多肽與MHC－Ⅱ類分子結合，從而誘導CD4＋Th2細胞產生體液免疫應答；而且還能誘導CD4＋Th1細胞產生各種細胞因子激活細胞和體液免疫。目前腫瘤DNA疫苗的研究已經進入了臨床實驗階段。很多臨床實驗證明，DNA疫苗是一種安全有效的抗癌手段，高效而且費用低。

腫瘤DNA疫苗需要激活腫瘤細胞上的能引起微弱免疫反應的腫瘤抗原，腫瘤抗原分為兩大類：腫瘤相關抗原和腫瘤特異抗原［25］。腫瘤相關抗原不只是由腫瘤細胞表達，在很多正常細胞中也有，如癌癥－睪丸抗原，人類表皮生長因子受體／神經鞘膜蛋白，癌胚抗原［26］。目前研究者已經發現了很多腫瘤相關抗原，并用于腫瘤的基礎研究與臨床治療。由于目前的生物技術發展迅速，新的腫瘤相關抗原還在不斷地發現。不過，需要注意的是，腫瘤相關抗原在正常組織中也存在，所以DNA疫苗針對的靶點必須仔細選擇以防止出現自身免疫。腫瘤特異抗原是由物理或者化學致癌物導致的突變造成的，它們只在腫瘤細胞中表達，如黑色素細胞／黑色素瘤差異抗原，酪氨酸酶，MART1，gp100，前列腺特異抗原（PSA）［27－29］。

2 腫瘤基因治療相關載體

用于腫瘤基因治療的生物類載體有病毒載體和非病毒載體等。病毒是一種非常簡單非常原始的生命形式，病毒可以感染人或者動物，將其基因帶入宿主細胞，在宿主細胞中復制與表達出病毒的蛋白質。通過基因工程手段可以將病毒的基因進行改造，將目的基因插入病毒的基因組，當病毒感染宿主后目的基因可以在宿主細胞中表達。病毒類載體最常見的有腺病毒、逆轉錄病毒載體和腺相關病毒載體。其他能作為載體病毒還有單純皰疹病毒、痘病毒、脊髓灰質炎病毒、新城疫病毒等等。病毒作為基因治療的載體有靶向性好，轉染效率高等特點，所以目前應用非常廣泛，有些病毒載體已經進入臨床實驗階段或已經被批準成藥［30］。不過，病毒載體依然有安全性的問題；而且病毒具有免疫原性，再次感染有一定的困難。另外，病毒作為載體所攜帶外源基因的大小有一定的限制。非病毒性載體主要有脂質體轉導系統，納米粒材料等。非病毒性載體是一種安全性良好的載體。但是相比病毒載體，它的轉染效率要低一些。非病毒載體制備較為簡單，攜帶的外源基因的容量也比較大，而且保存與運輸方便［31］。此外還有一些物理方法可以在基因治療的給藥中使用，比如電穿孔、基因槍、顯微注射等，這些都是有效并有應用前景的方法。

3 前景與展望

基因治療作為一種全新理念的治療方法取得了非常大的成就。目前已經有多種基因治療的產品已經批準上市或者進入臨床實驗階段，比如編碼p53基因的腺病毒產品已經在我國獲批用于臨床。腫瘤基因治療雖然目前發展很快，但是還有很多問題沒有解決。很多動物實驗結果良好，但是在對于人體效果卻不理想。有很多待解決問題，比如如何發現更加高效的載體、怎樣增加基因治療的靶向性、怎樣發現更有效的基因靶點、怎樣保證基因治療的安全性等等。相信隨著科學的進步，基因治療手段的不斷革新，腫瘤的基因治療必將擁有更加廣闊的應用前景。

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