用于人胚肺二倍體細胞培養的MEM產品比較試驗

李宏濤

(無錫市美迪生物制品有限公司 江蘇 無錫 214000)

近幾年隨著國產細胞培養基的廣泛應用,所占市場份額也逐步擴大,大多數生物制品企業已逐步認可了國產細胞培養基的質量[1～2]。目前,僅有小部分產品尚未實現替代。最典型的例子就是日本日水公司生產的MEM。該培養基現主要用于人胚肺二倍體細胞的培養。人胚肺二倍體細胞是甲肝疫苗、水痘疫苗、風疹減毒活疫苗、脊髓灰質炎疫苗、成纖維細胞干擾素等產品的生產用細胞[3～6],所用細胞培養基均為MEM。據長春生物制品所和長春長生生物技術有限公司介紹,他們均使用日水公司MEM生產甲肝疫苗。近來也試用過其他公司(包括一些知名外國公司)生產的細胞培養基,效果均不理想。但日水公司MEM中含有抗生素卡那霉素,而國家食品藥品監督管理局在2009年第6號公告“關于進一步規范生物制品質量控制要求的通告”中已明文規定生物制品生產中應盡可能避免使用抗生素。為此,尋找替代日水公司MEM細胞培養基的工作已成必然。我們將無錫美迪生物制品有限公司的用于二倍體細胞培養的2種MEM與日水公司MEM做了比較,獲得較滿意的結果。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用培養基為無錫市美迪生物制品有限公司生產MEM(不含硫酸卡那霉素)批號091028;日本日水公司MEM批號606903;杭州四季青小牛血清批號090411-3;Sulforhodamine B(sigma);三氯乙酸、乙酸、三羥甲基胺基甲烷均為分析純;臺盼藍(sigma);酶聯免疫檢測儀3022A(華東電子管廠);96孔細胞培養板(Falcon 3072);方瓶(corning)。

1.2 細胞

試驗所用人胚肺二倍體細胞2BS株由長春長生生物科技有限公司甲肝疫苗室提供,代次為33代。

1.3 方法

1.3.1 培養液配制 將2種培養基干粉按說明書溶解于三蒸水中,高壓滅菌后,冷卻至室溫;加入29.3mL/L的7.5%無菌碳酸氫鈉溶液和10mL/L的0.2mol/L無菌谷氨酰胺溶液,混勻。生長液和維持液分別加入小牛血清10%和2%。

1.3.2 細胞復蘇 從液氮容器中取出凍存管,于37℃溫水中速融。用吸管吸出細胞懸液至離心管中,滴加10倍以上生長液,混勻;1000rpm離心5min;棄上清液,加入生長液重懸細胞;計數后調整細胞密度,接種至培養瓶,37℃培養箱靜置培養;次日更換1次培養液,繼續培養。

1.3.3 細胞生長動力學實驗 (1)方瓶培養用于觀察細胞形態并計數。將復蘇好的2BS細胞經計數后,按3.5×104cells/cm2接種細胞在150mL培養瓶中,加入20mL培養液,置于37℃培養箱中培養。分別在培養12、24、36、48、60h和72h觀察細胞形態。用0.25%胰蛋白酶消化細胞后計數細胞數量。將細胞懸液0.5mL加入試管中,加入0.5mL0.5%臺盼藍溶液染色2～3min,吸取少許懸液涂于載玻片上,鏡下取任意視野計數200個細胞。死細胞能被臺盼藍染上色,鏡下可見深藍色的細胞,活細胞不被染色,鏡下呈無色透明狀。計算活細胞率=(未著色細胞數/200)×100%。(2)96孔板培養用于比較細胞生長周期。以10000個細胞/孔接種于96孔細胞培養板,加入不同MEM培養液,于37℃培養箱中培養。分別于12、24、36、48、60、72h取出培養板,于每孔加入50uL在4℃預冷的50%三氯乙酸,靜置5min后移入4℃冰箱中靜置1h,取出用水洗5遍,空氣中完全干燥,每孔加入0.4%的SRB 100uL,染色20min后倒掉染液,用1%乙酸洗5次,去除未結合的染料。空氣中干燥后用pH10.5的10mmol/L Tris液150uL溶解,在平板振蕩器上振蕩5min,在酶標儀上測定各孔在515nm的光吸收A,比較細胞生長周期。(3)細胞維持能力比較。細胞在生長液中培養72h之后,更換含2%小牛血清的維持液,置35℃恒溫箱中繼續培養72h,觀察細胞形態并計數。

2 結果

2.1 2種培養液下細胞生長過程中的細胞形態、細胞生長周期

二倍體細胞2BS株在2種MEM培養液中,分別培養12、24、36、48、60h和72h,在顯微鏡下觀察比較細胞生長形態,細胞在貼壁、伸展、聯網以及單層等各生長階段形態相似,均無顯著差異。經胰蛋白酶消化后,計數收獲的平均細胞數量分別為(105cells/mL)2.35、3.68、5.65、7.66、9.92、11.2和2.31、3.79、5.42、7.35、9.62、11.0,經統計分析,2種培養基下培養的細胞生長速率基本相同,兩者無顯著差異(P＞0.05)。

2.2 2種培養液下細胞活性比較

用2種培養液連續傳3代細胞,考察2種培養基對細胞活性的影響。每次傳代同時留取細胞懸液,用血球計數板在顯微鏡下計數,每次計數10個板,記錄平均值;用臺盼藍拒染試驗測定活細胞數量。計算平均活細胞率分別為96.8%、97.3%、97.1%和96.6%、97.8%、97.4%。統計分析,2種培養基均能使細胞保持較好的活力,P＞0.05無顯著差異。

2.3 2種培養液對細胞的維持能力

考察2種培養基營養物質及緩沖系統對細胞維持的影響。細胞在2種生長液中培養72h之后,培養液pH分別為7.07和7.04,細胞均形成致密單層;更換含2%小牛血清的維持液,置35℃恒溫箱中維持培養72h,測得維持液pH分別為7.15和7.12,細胞形態無差異;繼續維持48h,pH分別為6.98和6.96,2者均有少量圓縮細胞出現。試驗表明兩種MEM都可在低血清條件下維持培養2BS細胞120h以上,且細胞形態無顯著差異,培養液緩沖能力基本相同。

3 討論

人胚肺二倍體細胞相對于其他哺乳動物細胞而言略顯嬌氣,表現為消化時間長短以及使用的消化液種類對細胞后期增殖影響較大。開始階段我們使用EDTA進行消化,細胞狀態一直調整不好;后改用胰蛋白酶進行消化才解決了這一問題。因此如何掌握好二倍體細胞的傳代消化應值得注意。細胞按1：3傳代培養3～4d后形成單層;但若以1：5傳代則細胞不易連接成片,容易導致空洞產生。本實驗未發現卡那霉素對二倍體細胞增殖有何影響,但對病毒繁殖是否存在影響還有待探究。美迪公司MEM和日水公司MEM在人胚肺二倍體細胞培養過程中,細胞貼壁時間、細胞形態、分裂速度、增殖數量、維持時間等均無明顯差異,完全可以支持人胚肺二倍體細胞的生長。

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