蒙藥巴特爾-7體外對胃癌細胞生長的影響

鄧秀玲 劉淑萍 王棟

惡性腫瘤嚴重威脅著人們的生命，它的發生、發展與細胞異常增殖和分化有關，如何抑制腫瘤細胞的無限增殖能力，是腫瘤治療的一個基本問題。本實驗探討蒙藥巴特爾-7對胃癌細胞生長的影響，為抗腫瘤蒙藥的進一步開發提供一些理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 培養基DMEM為Gibco公司產品，胎牛血清為中國醫學科學院血液學研究所生產，噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)均為Sigama公司產品。蒙成藥巴特爾-7(以下簡稱蒙藥)、由內蒙古中蒙醫院制劑室生產，用PBS配成50 mg/ml貯液，0.2 mm濾膜過濾除菌4℃保存，實驗時用培養液稀釋到所需濃度。

1.2 細胞培養 MGC-803細胞由北京腫瘤研究所提供，于含慶大霉素80U/ml、10%滅活胎牛血清的DMEM的培養液中培養，置37℃、5%CO2溫箱中孵育，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 蒙藥對胃癌MGC-803的細胞殺傷作用：采用噻唑藍比色法(MTT法)，取對數生長期的MGC-803細胞，經消化液消化后制成單細胞懸液，調整細胞濃度為3×104個/ml接種96孔培養板，吹打均勻，每孔接種細胞懸液100 μl，置37℃、5%CO2溫箱中孵育。24 h后實驗組分別加入不同濃度的蒙藥，終濃度分別為 2.5、1.25、0.63、0.31、0.15 mg/ml。另設陰性對照組(只有細胞，不加藥)，空白對照組(只含等量培養基，無細胞和藥)。各處理組設8個復孔。以上各處理組總體積均為200 ul。加藥后繼續培養72 h，每孔加入20 ulMTT(5mg/ml)37℃溫育4 h，離心棄上清后每孔加200 ulDMSO，振蕩10 min。選擇570 nm波長，酶標儀上檢測各復孔吸光度(A值)。進行數據統計時，每組去除一個最大值和最小值，按下列公式計算細胞生長抑制率。

抑制率%=(對照組平均A值-實驗組平均A值)/(對照組平均A值-空白組平均A值)×100%

1.4 細胞形態變化觀察 ①倒置光顯微鏡觀察：將MGC-803細胞以6×105個/ml接種于75 ml培養瓶中，培養24 h，更換培養液，對照組細胞用DMEM繼續培養，實驗組細胞加入含蒙藥的培養基，培養后每6 h觀察細胞形態變化。②熒光雙染檢測細胞核形態變化：收集蒙藥處理24、36、48 h的細胞，離心、洗滌后制成細胞懸液，hochest33342和PI熒光染色、洗滌后滴片，于熒光顯微鏡(日本Nikon)下觀察。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測 收集2.5 mg/ml不同時間處理組細胞1.8×106個，按文獻1方法提取DNA。取DNA樣品20 ul與上樣緩沖液按6∶1混勻，上樣于凝膠樣品孔中，于0.5 TBE電泳緩沖液中進行電泳，55 V，2～3 h。

2 結果

2.1 蒙藥對MGC-803細胞殺傷作用 從表1可見，巴特爾-7能顯著抑制細胞的生長，與陰性對照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)。且隨著藥物劑量增加，抑制率逐漸增高。計算半數抑制濃度(IC50)1mg/ml。

表1 蒙藥對胃癌MGC-803細胞的生長影響

2.2 細胞形態學觀察 倒置光鏡下見，對照組細胞呈不規則多角形生長，細胞均質而透明，生長旺盛。低濃度巴特爾-7處理24 h后既有少數細胞開始變圓，細胞皺縮，細胞增殖速度減慢。2.5 mg/ml藥物作用24 h后部分細胞已變圓，體積變小，細胞表面變得粗糙，出現“吐泡”現象，形似梅花狀改變，呈現出凋亡細胞的形態改變。隨著作用時間延長，細胞亮度明顯下降，凋亡細胞數目逐漸增加。熒光雙染后，可見對照組細胞核均勻一致，被Hoechst/33342染成藍色熒光。2.5 mg/ml藥物作用48 h細胞核染色質凝集、碎裂、凋亡小體形成。

2.3 DNA電泳檢測 對照組在距點樣孔附近有一條亮帶，2.5 mg/ml娜仁處理細胞24 h電泳時隱約可見“梯狀帶”，36 h、48 h處理組未見梯狀帶的出現。

3 討論

蒙醫藥是蒙古民族特有的醫藥，蒙醫以經驗醫學為主，積累了許多經驗方用于治療各種腫瘤，并取得了一定的療效［2，3，4］。本實驗將巴特爾-7作用于體外培養的胃癌細胞，發現其可明顯抑制胃癌細胞的生長，且呈現劑量依賴性的細胞毒作用。這與一些復方中藥［5-7］體外抗腫瘤的細胞毒作用相似。在倒置光顯微鏡下觀察，藥物作用后部分細胞皺縮、體積變小，細胞出現“吐泡”現象，呈現凋亡細胞的形態學變化。為進一步證實倒置光顯微鏡下的觀察結果，我們采用Hoechst3342/PI雙重染色，來觀察細胞核的變化，也顯示了凋亡細胞的改變。提示該蒙藥可能具有誘導細胞凋亡的作用。

自1980年Wyllie［8］把內源性核酸內切酶降解DNA產生的“梯形帶”與細胞凋亡相聯系，DNA的ladder帶一直被認為是鑒定細胞凋亡的重要生化標志。本實驗DNA電泳沒有出現典型的凋亡“梯形帶”，巴特爾-7作用24 h電泳隱約可見“梯形帶”。其他時間組未見“梯形帶”，但也沒有壞死細胞DNA涂抹狀的拖帶現象。提示巴特爾-7作用方式較溫和，可能在早些時候DNA被降解成大的片段。有學者認為大片段的形成可能發生在細胞凋亡早期，寡核甘酸片段則出現于凋亡晚期，但有些研究則認為，在凋亡晚期不一定出現小片段。趙小英等［9］在研究紫杉醇對K562細胞的凋亡誘導作用中也觀察到此現象的發生。譚宇蕙等［10］報道小糵堿對人胃癌MGC-803細胞生長抑制及誘導凋亡的作用實驗中也出現本結果。本實驗結果表明巴特爾-7可抑制體外培養的胃癌細胞的生長，這種抑制作用是通過誘導細胞凋亡還是通過其他機制實現的尚需進一步研究。

［1］奧斯伯.布倫特.精編分子生物學實驗指南．科學出版社，1998：32-35．

［2］武超，馬東野.蒙藥烏門-17味散治療晚期食管賁門癌234例臨床觀察.中國民族醫藥雜志，2001，4(7)：12-13．

［3］陳露華，趙宇明.蒙醫藥治療原發性肝癌的機理探討.中國民族民間醫藥雜志，2000，42：15-18．

［4］李蘭英，田國才.那如注射液激活腹腔巨噬細胞的體內抗L615白血病的作用.內蒙古醫學院學報，1995，17(1)：34-37．

［5］王洪峰，宋穎，史祺云，等.吳茱萸堿對人胃低分化黏液腺癌MGC-803細胞作用的研究.長春中醫藥大學學報，2010，(02)：185-186．

［6］白英，李華.白英水提物誘導人SGC-7901細胞凋亡的實驗研究. 時珍國醫藥，2009，20(10)：2509-2511．

［7］楊策堯，楊麗紅.復方象膽水煎劑的體外抗腫瘤試驗研究.海南醫學，2003，14(7)：72-73．

［8］Wyllie AH，Cell death：the significance apoptosis.Natrure，1980，284：555．

［9］趙小英，徐磊，張曉紅，等.紫杉醇對K562細胞增殖抑制作用及誘導凋亡的作用.實用腫瘤學雜志，2002，17(6)：376-378．

［10］譚宇蕙，陳冠林，郭淑杰，等.小糵堿對人胃癌MGC-803細胞生長抑制及誘導凋亡的作用.中國藥理學通報，2001．12(1)：40-43．