利多卡因氯己定氣霧劑無菌檢查法的驗證試驗

胡文紅 王德利

利多卡因氯己定氣霧劑為復方制劑，其主要組分為利多卡因、醋酸氯已定和苯扎溴銨，用于一般割傷、擦傷軟組織損傷、灼傷、曬傷以及蚊蟲叮咬、熱痱瘙癢等。根據《中國藥典》2010年版二部規定，用于手術、燒傷及嚴重創傷的局部給藥制劑需進行無菌檢查。筆者按《中國藥典》2010年版二部規定無菌檢查驗證試驗用的4株細菌、2株真菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉)對兩個生產廠家的樣品進行了無菌檢查的驗證試驗，以確認所采用的方法是否適合于該制劑的無菌檢查［1］。現將結果報告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BSC-1500ⅡA2-X生物潔凈安全柜;MJ-250I生化培養箱;GHP-9270隔水式恒溫培養箱;SartoriusCP225 d電子天平;HTY-2000B集菌儀(杭州泰林醫療器械廠生產);PY220、PY330一次性全封閉集菌器(杭州泰林醫療器械廠生產)。

1.2 培養基 營養瓊脂培養基 (100409)、玫瑰紅鈉瓊脂培養基(090518)、營養肉湯(090922)、改良馬丁培養基(100108)、硫乙醇酸鹽培養基(100323)均購于北京三藥科技開發公司

1.3 稀釋液(沖洗液) pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液購于北京三藥科技開發公司、含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(自配)。

1.4 實驗用樣品 利多卡因氯己定氣霧劑(規格：60 g/瓶)分別為山東京衛制藥有限公司(批號：0904008)、濟南為民制藥有限公司(批號：091020)

1.5 菌株 大腸埃希菌(Eschrichia coli)［CMCC(B)44 102］、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64941］、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］、白色念珠菌 (Candida albicans)［CMCC(F)98 001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］均購于中國生物制品檢定所醫學菌種保藏中心，以上菌種均為第3代菌種。

2 方法與結果

2.1 菌液制備［1］按《中國藥典》2010年版二部附錄“無菌檢查法”項下方法制成小于100 cfu/ml的菌懸液。

2.2 驗證試驗

2.2.1 樣品的取樣量 根據《中國藥典》2010年版二部無菌檢查法的有關規定［1］，驗證試驗時每一株驗證菌株需要的樣品量相當于每一濾筒的樣品量。按此樣品的規格：60 g/瓶，取樣量為5瓶/筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共5 g，混勻后，備用。

2.2.2 稀釋液的選擇試驗 取本品5瓶/筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共5 g，混勻后，分別轉移至200 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋液中，振搖后，取PY220一次性全封閉集菌器(兩聯)一套，按薄膜過濾法處理，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗液分別沖洗濾膜3次，每次100 ml/膜，泵入相同培養基后，于兩筒中分別接入小于100 cfu/ml的試驗菌。前者作為陽性對照筒，后者作為試驗筒。各試驗菌同法操作。再取硫乙醇酸鹽培養基及改良馬丁培養基分別泵入另兩筒集菌器中，作為陰性對照筒。按規定溫度將述集菌器培養3～5 d。其結果見表1。

表1 稀釋液的選擇試驗結果

2.2.3 表1結果表明，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋液，在規定溫度培養后，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌均有抑制作用，各試驗筒均未有菌生長，陽性對照筒生長良好;但對大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉無抑制作用，試驗筒和陽性對照筒均生長良好;而用含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作稀釋液，在規定溫度培養后，對驗證試驗用的6種標準菌株均無抑制作用，各試驗筒和陽性對照筒均生長良好。

2.2.4 沖洗液的選擇試驗 取本品5瓶/筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共5 g，混勻后，轉移至200 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，振搖后，取PY220一次性全封閉集菌器(兩聯)一套，按薄膜過濾法處理，分別用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、含1%聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作沖洗液分別沖洗濾膜3次，每次100 ml/膜。以下操作步驟同前。其結果見表2。

表2 沖洗液的選擇試驗結果

2.2.5 表2結果和表1結果完全一致。從以上試驗結果可知，把1%聚山梨酯80加在稀釋液或沖洗液中作為中和劑來消除藥品的抑菌作用效果是一樣的。兩個生產廠家的產品同法操作，結果也完全一致。

2.2.6 中和劑的驗證試驗［2］證明一種中和劑是否適當主要基于兩點，一是對微生物生長的毒副作用，二是有效性。

毒副作用：方法同上。取1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液300 ml濾過集菌器，分別泵入100 ml硫乙醇酸鹽培養基和改良馬丁培養基，再分別接入小于100 cfu/ml的各試驗菌。按規定溫度培養、觀察。結果見表3。表3結果顯示，用于無菌檢查驗證試驗用的6株試驗菌株在此條件下均生長良好。

表3 毒副作用試驗結果

有效性：由表1、2中可見，在pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中添加1%聚山梨酯80，不筒當稀釋液還是沖洗液，都能有效地降低藥品的抑菌性，使檢驗方法簡化、便于操作，提高準確性，符合驗證試驗要求，可以作為中和劑。

3 利多卡因氯己定氣霧劑無菌檢查方法

取本品15瓶/3筒，且每瓶取樣量不少于1 g/瓶，共15 g，混勻后，轉移至200 ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(或含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)稀釋液中，振搖，經薄膜過濾法處理，用含1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(或pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)作沖洗液分次沖洗(每膜不少于300 ml)，每次100 ml/膜，以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，依法檢查(中國藥典2010年版二部附錄ⅪH)，應符合規定。

4 討論

4.1 中和劑的濃度 在實驗過程中，筆者還分別對1%聚山梨酯80、3%聚山梨酯80、5%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液進行了考察，試驗結果顯示，三個濃度的中和劑均有一定的中和作用。但隨著濃度的增加，緩沖液的粘稠度也隨之增強，振搖后，泡沫也隨之更加豐富，對濾膜過濾不利。因此，一般情況下，建議選用1% ～3%聚山梨酯80就能滿足此樣品的試驗要求。

4.2 中和劑的選擇 本樣品處方中主要成分之一苯扎氯銨為季銨化合物，是目前廣泛應用的抗菌劑，它對革蘭氏陽性菌作用強，但對大腸埃希菌、抗酸桿菌等無效。據文獻報道，聚山梨酯80為非離子表面活性劑，可降低季銨類化合物、酚、醛、對羥基苯甲酸類、洗必泰類、石炭酸類藥物的活性［3］。利用這一特點，本文通過驗證試驗建立了以1%聚山梨酯80為中和劑的利多卡因氯己定氣霧劑無菌檢查方法，結合薄膜過濾法，有效去除其抑菌活性。另外，針對一些藥物存在某些抑菌活性問題，在無菌檢查的過程中篩選可降低其活性的中和劑的思路，為其他品種藥物中和劑的篩選提供了選擇方向。

［1］中國藥典 .2010．二部：Appendix，103．

［2］霍秀敏，微生物檢查方法驗證與評價要求.藥品技術評審論壇，2008，3：50．

［3］蘇德模，馬緒榮.藥品微生物學檢驗方法.北京：華齡出版社，2007：216．