乙草胺對昆明小鼠肝臟病理性變化的研究

王志勇，許曉曦，李 瑩，卓志國，滕國新

（1.東北農業(yè)大學食品學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江農業(yè)工程職業(yè)學院動物科技學院，哈爾濱 150088；3.哈爾濱市質量技術監(jiān)督局，哈爾濱 150001；4.黑龍江中醫(yī)藥大學成人教育學院，哈爾濱 150040；5.北京三元食品有限責任公司，北京 100085）

乙草胺(Acetochlor)，分子式C14H20ClNO2，分子質量為269.8。乙草胺原藥的危險等級是9類，屬于持久性有機污染物(POP)。大鼠急性口服LD50為 2 593 mg·kg－1。

乙草胺為內吸性酰胺類除草劑，是選擇性芽前除草劑。它具有較長的降解周期，對人、動植物有一定的毒害作用[1]。乙草胺已經(jīng)被美國環(huán)境保護局定為B-2類致癌物，并規(guī)定地下水中的乙草胺殘留量不得超過0.10 μg·L-1[2-3]。日本肯定列表名錄中嚴格限制乙草胺的殘留量，最低限量為0.020 mg·kg-1[4]。隨著我國20世紀90年代初乙草胺生產的產業(yè)化，它的使用日益廣泛，2003年我國乙草胺的消耗量已經(jīng)達到了l.0×104t[5]。同時，資料顯示地表水、地下水，甚至飲用水中也被檢測出含有不同含量的乙草胺[6-9]。因此，乙草胺的安全性也越來越受到人們的關注，但目前關于乙草胺對動物體及人體的損傷研究尚未見報道：根據(jù)本研究結果，后續(xù)研究可以對奶牛食料中的乙草胺殘留量進行檢測分析，同時對原料奶進行檢測，確立奶牛食用含有乙草胺的食物，通過消化吸收轉移到原料乳中的劑量-反應關系。最終根據(jù)風險評估的方法，對原料乳中乙草胺的殘留進行風險評估，為今后的預防工作指引方向，為政府部門采取適當?shù)墓芾泶胧┨峁┮罁?jù)，降低食源性疾病的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

受試物為乙草胺農藥標準品，購自Sigma公司（純品，分子質量為269.77 g·mol-1）；超純水，由娃哈哈純凈水制得；昆明小鼠，哈爾濱市漢方試驗鼠類養(yǎng)殖所提供，許可證scxk(京)（2007-0001）；帶蓋塑料鼠籠；灌胃器；電子天平，Acculab ALC-1100.2與ALC-310.3型；組織切片機，萊卡2135型；顯微鏡，萊卡Leica DM IRB等。

1.2 方法

1.2.1 昆明小鼠飼養(yǎng)

1.2.1.1 試驗動物分組

選用同一天出生的，2月大的健康昆明系小鼠120只，購自哈爾濱市漢方試驗鼠類養(yǎng)殖所。將體重平均為（25±2）g雄性和雌性的健康小鼠,按體重隨機分成5組,組間平均體重相差小于0.5 g，每組雌雄各12只，共120只，每組12只再分成3只鼠籠飼養(yǎng)，馴化飼養(yǎng)1周后開始灌胃。設計濃度參考小鼠急性口服LD50、日本進口食品對其限量實行“一律標準”及90 d喂養(yǎng)試驗標準。灌胃劑量和分組如表1所示。

1.2.1.2 動物飼養(yǎng)和管理

昆明小鼠飼養(yǎng)在專用飼養(yǎng)動物舍中，室內平均溫度 (22±4)℃,濕度55%±10%,自然光光照，空氣經(jīng)過濾，換氣4次·d-1，噪音60 dB以下，采用自動飲水裝置供動物飲用，動物在懸掛式塑料籠內飼養(yǎng)，飼料為無菌粉料。試驗期間動物自由攝食飲水。

表1 昆明小鼠灌胃試驗劑量設計Table 1 Design of feed dose in Kunming mice experimen

1.2.2 臨床觀察

體重稱量10 d 1次，每天觀察2次昆明小鼠，瀕臨死亡的昆明小鼠每天觀察4次。

1.2.3 病理檢查

試驗期間瀕臨死亡或者自然死亡的昆明小鼠，隨時解剖，活體在試驗終期全部解剖。取肝臟，稱肝臟重與體重。標本經(jīng)體積分數(shù)為10%的中性福爾馬林緩沖液固定5～7 d，取材之后再次固定12 h。組織以乙醇脫水，二甲苯透明,石蠟包埋，切片，HE染色，樹膠封固，光鏡檢查。記錄病變的種類及程度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應用Statistix 8.1軟件、LSD方法對比試驗數(shù)據(jù)分析小鼠試驗期間的體重變化差異是否顯著，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差（X±S）表示。

2 結果與分析

2.1 昆明小喂養(yǎng)期間臨床表現(xiàn)

試驗前期，各組昆明小鼠均有死亡現(xiàn)象，經(jīng)病理檢查為非中毒原因死亡，肝臟無明顯病變，個別死亡原因不明。隨著試驗的進行，試驗后期死亡的昆明小鼠，都出現(xiàn)少動、被毛蓬松、并出現(xiàn)輕微震顫等中毒癥狀。經(jīng)解剖觀察發(fā)現(xiàn)，有3只昆明小鼠肝臟明顯出現(xiàn)腫大現(xiàn)象，HE染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，這3只昆明小鼠肝臟脂肪粒增多，肝細胞出現(xiàn)了纖維化的現(xiàn)象。其余動物在整個試驗期間外貌、活動及一般狀況均正常,未明顯中毒表現(xiàn)。昆明小鼠喂養(yǎng)期間死亡情況如表2所示。

2.2 喂養(yǎng)期間體重和進食變化

試驗開始后各組動物攝食量基本穩(wěn)定。E組雄性小鼠第5周攝食量略有減少，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。試驗期間每十天測量一次每組小鼠平均體重，雌性、雄性小鼠各劑量組體重變化量見表3、4。

表2 昆明小鼠90 d喂養(yǎng)期間死亡情況Table 2 Death Status of Kunming mice during feeding period

表3 雄性昆明小鼠90 d喂養(yǎng)試驗體重變化Table 3 Weight change of male Kunming mice during 90 d feeding study (g)

表4 雌性昆明小鼠90 d喂養(yǎng)試驗體重變化Table 4 Weight change of female Kunming mice during 90 d feeding study (g)

應用Statistix 8.1軟件LSD方法對比分析表明，受試物組雄性小鼠與空白對照組雄性小鼠相比，體重下降差異顯著（P＜0.05）。

通過表3、4對比可以發(fā)現(xiàn)，用乙草胺灌胃的小鼠體重明顯下降，而空白對照組體重基本保持不變，E組與A組體重雄性降低約19.2%、雌性降低約14.7%。由于各組灌胃劑量低于LD0，乙草胺在試驗動物體內積累需要一個過程，同時小鼠達到成年后還有一個體重增加過程，因此在試驗前期各試驗組小鼠體重均有明顯的增加趨勢，空白對照組小鼠由于飼養(yǎng)期間溫度、喂食量、小鼠的年齡等因素的影響以及飼養(yǎng)過程中小鼠的死亡都會對小鼠的平均體重有一定的影響，因此在試驗的后半段小鼠的平均體重有一個降低的趨勢。隨著試驗的進行，乙草胺在小鼠的體內積累到一定數(shù)量，即產生了毒副作用，使小鼠出現(xiàn)了一系列病理反應：體重下降、活動減少、被毛蓬松、有輕微顫抖等，這與李華文、陸丹等做的乙草胺經(jīng)皮毒性的研究中的乙草胺中毒現(xiàn)象相似[12]。試驗結束前兩周內死亡的小鼠體重都小于平均體重，受試物組小鼠與空白對照組相比體重下降差異顯著（P＜0.05）。

2.3 實驗小鼠肝臟與體重比

劉陽等研究發(fā)現(xiàn)，乙草胺可以使其靶器官--肝臟中的抗氧化酶受到抑制、損傷肝臟細胞的DNA、誘發(fā)肝臟組織細胞損傷[10]。林麗白等研究表明乙草胺中毒機制主要在肝內經(jīng)非特異性酰胺酶作用,迅速水解為相應的酸或在某些情況下以原形排出,從而影響機體組織所需的氧量,導致窒息、死亡[11]。

因此本研究通過測量肝臟與體重之比，來反映肝臟受損傷程度。肝臟與體重之比如表5所示。

試驗結束后，解剖小鼠測量小鼠肝臟和體重，雄性鼠肝臟與體重比值平均值差異不顯著（P＞0.05），而雌性鼠肝臟與體重比值平均值差異顯著（P＜0.05）。這表明了與雄性鼠相比，在喂食相同劑量的乙草胺的情況下，雌性鼠肝臟更易受到損傷。

表5 不同劑量組昆明小鼠肝臟與體重比值的平均值Table 5 Ratio of liver to body weight of Kunming mice in different dose groups

2.4 HE染色鏡檢觀

試驗期間瀕臨死亡或者自然死亡的小鼠，隨時解剖，活體在試驗終期全部解剖。取肝臟，稱肝臟重與體重。標本經(jīng)體積分數(shù)為10%的中性福爾馬林緩沖液固定5～7 d,取材之后再次固定12 h。組織以乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色,樹膠封固。光鏡圖片放大倍數(shù)為目鏡10×物鏡20，即200倍放大條件下鏡檢。肝臟損傷鏡檢圖見彩版Ⅰ。

經(jīng)HE染色鏡檢觀察小鼠肝臟切片發(fā)現(xiàn)，受試物組與空白對照組相比脂肪明顯增多、肝臟細胞明顯出現(xiàn)纖維化，劑量越大差異越明顯，這表明昆明小鼠肝臟已經(jīng)受到了不同程度的損傷。

3 討論

通過對試驗期間小鼠體重的監(jiān)測，以及試驗結束后對測量小鼠臟器比并對肝臟進行HE染色鏡檢，記錄數(shù)據(jù)，應用Statistix 8.1軟件LSD方法對比分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：

a.灌胃乙草胺的小鼠體重明顯下降，而空白對照組體重基本保持在一個相對穩(wěn)定的體重上下波動，在試驗的后期開始下降。這是由于小鼠已經(jīng)成長到相當于人的四五十歲的年齡階段，過了壯年時期，進入了中老年時期，體重和身體機能都開始下降了。同時飼養(yǎng)期間溫度、喂食量、小鼠的年齡、以及飼養(yǎng)過程中小鼠的意外死亡等因素對空白對照組小鼠體重的稱量結果會產生一定的影響，因此在試驗中空白對照組小鼠的平均體重在一定的體重范圍內波動，試驗后期有降低的趨勢（如表3與表4中A組所示）。

b.E組與A組體重相比 (如表3、4中所示)，雄性小鼠體重降低約19.2%、雌性小鼠體重降低約14.7%。由于各組灌胃劑量低于LD0，乙草胺在試驗動物體內積累需要一個過程，同時老鼠達到成年后還有一個體重增加過程，因此在試驗前期各試驗組小鼠體重均有明顯的增加趨勢。隨著試驗的進行，乙草胺在小鼠的體內積累到一定量，產生了毒副作用，小鼠出現(xiàn)了一系列病理生理反應，開始出現(xiàn)體重下降、活動減少、被毛蓬松、有輕微顫抖等中毒現(xiàn)象，這與李華文、陸丹等做的乙草胺經(jīng)皮毒性的研究中的乙草胺中毒現(xiàn)象相似[12]。試驗結束前兩周內死亡的小鼠體重都在23 g以下，受試物組小鼠與空白對照組相比體重下降差異顯著（P＜0.05）。

c.試驗結束時宰殺活體小鼠，取肝臟計算各劑量組的小鼠肝臟與體重的比值，如表5所示，雄性小鼠臟器比差異不顯著（P＞0.05），雌性小鼠臟器比差異顯著（P＞0.05），這表明與雄性小鼠相比，在灌胃相同劑量乙草胺的情況下，雌性小鼠肝臟更易受到損傷，同時對比試驗期間雄性小鼠與雌性小鼠的體重變化可知，乙草胺對雌性小鼠的毒性作用比雄性小鼠強。說明乙草胺的毒性作用存在著性別的差異。

d.經(jīng)HE染色鏡檢觀察小鼠肝臟切片發(fā)現(xiàn)（見彩版Ⅰ），受試物組與空白對照組相比脂肪明顯增多、肝臟細胞之間的間隙變大、肝臟細胞明顯出現(xiàn)纖維化，投藥劑量越大這種差異越明顯，這表明小鼠肝臟已經(jīng)受到了不同程度的損傷。而劉陽等研究發(fā)現(xiàn)，乙草胺可以使其靶器官—肝臟中的抗氧化酶受到抑制、造成肝臟細胞的DNA損傷、誘發(fā)肝臟組織細胞損傷[10]。

4 結論

通過上述研究表明，即使低濃度乙草胺長期攝入，也能夠導致昆明小鼠出現(xiàn)累積性中毒反應，使其肝臟內脂肪增加，并導致肝臟出現(xiàn)組織纖維化，個別動物肝臟腫大。從病理學角度，繼續(xù)攝入必將發(fā)展為肝硬化，導致肝功能喪失，而肝癌與肝硬化

關系密切。因此，人們如果長期低劑量的攝入乙草胺，會大大增加肝臟癌變的幾率。

[1] 姚寶玉，王捷，于峰，等.乙草胺致癌病理學試驗的評價[J].衛(wèi)生毒理學雜志,2000,14(4):216.

[2] 裴道國，崔淑華，王雄，等.免疫親合柱凈化-氣相色譜質譜法測定花生和大蒜中乙草胺殘留量[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2008，20(5):418-420.

[3] 鄭和輝,葉常明.乙草胺和丁草胺在土壤中的移動性[J].環(huán)境科學,2001，22(5):117-121.

[4] 李愛軍，王明泰，宋立國，等.植物源性飼料中乙草胺殘留量的快速測定法[J].飼料研究，2007(10)：14-16.

[5] Ye C.Environmental behavior of the herbicide acetochlor in soil[J].Environmental Contamination and Toxicology，2003，71：919-923.

[6] Barbash J E，Thelin Q P，KoiPin D W.Major herbicides in ground water:results from the national water-quality assessment[J].Enviorn，2001，30：831-845.

[7] Xue N D，Xu X B，Jin Z L.Screening 31 endocrine-disrupting pesticides in water and surface sediment samples from Beijing cuanting reservoir[J].Chemosphere，2005，61：1594-1606.

[8] Clark G M,Goolsby D A.Occurrence and transport of acetochlor in streams of the missisipi river basin[J].Journal of Environmental Quality，1999，28：1787-1795.

[9] Karlkhoff S J,Kolpin D W,Thurman E M,et al.Degradation of chloroacetanilide herbicide:The prevalence of sulfonic and oxanilic acid metabolites in Iowa ground waters and surface waters[J].Environmental Science Technology,1998,32：1738-1740.

[10] 劉陽，張迎梅.除草劑乙草胺對花背蟾蜍肝臟的影響及機理[C].蘭州:蘭州大學,2006.

[11] 林麗白，陳家，陳小微，等.新型除草劑乙草胺原油的急性毒性研究[J].中國職業(yè)醫(yī)學，1995(2)：12-13.

[12] 李文華，陸丹，吳軍，等.乙草胺經(jīng)皮毒性的研究[J].毒理學雜志,2008，22(4)：327-329.