一株產纖維素酶絲狀真菌兼性厭氧液體發酵動力學的研究

賈翠英，歐行奇，王永輝

（1.河南科技學院生命科技學院,河南 新鄉 453003；2.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

纖維素是世界上最大的可再生有機資源，我國的纖維類資源極為豐富，僅秸稈和皮殼每年可達7×108t。目前對其主要的利用方式是作為低級燃料，腐化為肥和家畜過腹還田，因此，有效利用率低。

當前，許多國家已展開對纖維素利用的深入研究，主要集中在兩個方面：首先酶的基礎研究，即纖維素酶如何使一束纖維從不可溶的聚合物上脫離下來，催化的化學機制以及纖維素酶如何相互作用以實現協同效應；其次是酶在實現生物量轉化過程中的應用，即利用纖維素酶轉化可再生性的能源物質生產化工原料等[1]。然而，由于纖維素酶活力低，一直是阻礙大規模生產應用的瓶頸，加強纖維素酶產生菌菌種選育、發酵工藝及降解機制的基礎研究，利用高效轉化木質纖維素類的微生物技術，將天然纖維素降解為可利用的糖液，再進一步轉化為乙醇、乳酸、菌體蛋白、氣體燃料等物質，對解決能源危機和環境污染以及生態保護是可行的，同時也是必要的[2-5]。纖維素酶對纖維素的降解作用主要通過纖維素外切酶（1,4-β-D-glucan-cellbiohydrolases，EC 3.2.1.91,CBH）、內切酶（1,4-β-D-glucan-4-glucanases,3.2.1.4,EG）和纖維二糖酶（β-D-cellobiase,EC 3.2.1.21）三類酶的協同作用[6-8]，不同來源的菌株其纖維素酶的分子特征和催化性質都不盡相同，且酶的最適反應條件也有所不同[9-12]。微生物反應動力學包括細胞生長動力學、代謝產物生成動力學和基質消耗動力學[13]，通過對微生物反應動力學的研究和模型的建立，能更好的認識微生物發酵過程中菌體的生長和產物形成機制，以及影響這些機制的一些重要因素，最終實現發酵過程的有效控制，達到提高產物發酵指標的目的。

本文以本實驗室從羊瘤胃中篩選分離保存的一株絲狀真菌為研究對象，通過靜置液體發酵試驗，對該絲狀真菌體外轉化玉米秸稈產纖維素酶的發酵動力學進行了研究，并對動力學方程進行了模擬驗證,獲得較理想的結果，從而為進一步研究和利用其所產纖維素酶降解玉米秸稈纖維素提供必要的理論依據，同時對于環境保護、資源能源再利用等領域具有極大地實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

一株產纖維素酶絲狀真菌，由河南科技學院生命科技學院發酵工程實驗室篩選、分離、保存并提供,該菌株經分類鑒定為子囊菌屬絲狀真菌（Ascomycotinas sp.）。

1.2 試驗原料

玉米秸稈，新鄉市郊外田地里采集，100℃烘干，粉碎，過40目篩待用。

1.3 培養基

斜面活化培養基：土豆汁100 mL，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然。

液體種子培養基：土豆汁100 mL，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.5%，葡萄糖2%，pH自然。

發酵培養基：土豆汁100 mL，玉米秸稈12.5%（W/V），pH自然。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

無菌操作將所試絲狀真菌接種于斜面培養基,37℃培養72 h，連續活化兩代。

1.4.2 液體種子培養

無菌操作將所試絲狀真菌斜面培養物接種于盛有50 mL液體種子培養基的250 mL三角瓶，37℃靜置培養24 h，備用。

1.4.3 發酵培養

無菌操作將上述種子液按8%的接種量接種盛有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶內，37℃靜置發酵。

1.4.4 菌體生物量的測定[14]

菌體生物量的測定采用生理指標法中的菌體含碳量測定進行描述。

1.4.5 產物CMC-Na酶活力的測定

以CMC-Na酶為代表進行產物纖維素酶活力測定，其方法采用DNS試劑法[15]。首先進行葡萄糖標準曲線繪制，然后依照葡萄糖標準曲線繪制步驟進行發酵液中產物纖維素酶活性的測定。酶活定義為：1 mL粗酶液在1 min分解底物產生1 μg葡萄糖為1個酶活單位（U）。酶活計算方法如下：酶活=稀釋酶活測定值×1 000×稀釋倍數/反應時間。

表1 葡萄糖標準曲線制作Table 1 Preparation of standard curve of glucose(mL)

1.4.6 底物玉米秸稈纖維素消耗的測定

利用硫酸蒽酮法測定纖維素含量[16]，取6支小試管，按照表2分別加入各種試劑，塞上塞子、充分混勻后靜置1 min，然后在620 nm下，測定不同含量纖維素溶液的吸光度，以測得的吸光度為縱坐標，橫坐標表示纖維素含量，繪制纖維素含量的標準曲線。發酵液中纖維素含量測定同纖維素含量標準曲線繪制步驟。

表2 纖維素標準曲線制作Table 2 Preparation of standard curve of cellulose (mL)

2 結果與分析

2.1 菌體生物量標準曲線

重鉻酸鉀法測定生物量所制作的菌體生物量標準曲線見圖1。由圖1可知，菌體濃度在0.1～0.8 g·L-1范圍內時，吸光度與菌體濃度成正相關，其相關系數R2=0.99546,可知該標準曲線可以用于菌體生物量的計算，可為菌體生長動力學模型建立和驗證時的數據計算提供依據。

圖1 菌體生物量標準曲線Fig.1 Standard curve of mycelium biomass

2.2 葡萄糖標準曲線

DNS法測定葡萄糖含量所制作的葡萄糖標準曲線見圖2，由圖2可以看出，當葡萄糖濃度在0.1～0.35 g·L-1范圍內時，吸光度和葡萄糖濃度之間有著良好的線性關系，相關系數R2=0.99554，可知該葡萄糖標準曲線能較好地進行產物CMC-Na酶活力的測定和計算，為產物酶形成動力學模型建立和驗證時的數據計算提供依據。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.3 纖維素含量標準曲線

硫酸蒽酮法測定基質纖維素含量所繪制的纖維素含量標準曲線見圖3。由圖3可知，纖維素濃度在40～180 mg·L-1范圍內，吸光度和纖維素濃度具有良好的線性相關性，其相關系數R2=0.99228。可知該纖維素含量標準曲線可用于玉米秸稈中纖維素含量變化的計算，從而用于基質纖維素消耗動力學模型建立和驗證時的數據計算提供依據。

圖3 纖維素含量標準曲線Fig.3 Standard curve of cellulose content

2.4 批式發酵試驗結果

批式發酵結果如圖4(a，b)。該絲狀真菌的各個生長階段比較分明。菌體生長的延滯期較長，18 h后逐步進入對數生長期，當發酵至72 h左右時，菌體生長達到穩定期，此后細胞生物量維持恒定，96 h獲得最大菌體干重為9.046 g·L-1。纖維素基質含量的變化為逐漸降低趨勢。而由產物酶的形成曲線可知，產物酶的形成與細胞的生長是同步的，其二者的關系表現為偶聯型，即菌體快速生長時產物酶也大量積累生成，菌體生長穩定期時產物酶不在大量積累而基本維持恒定。此外，由圖4還可知，底物纖維素消耗曲線、細胞生長曲線和產物酶的形成曲線三者有一定的相關性，即細胞在對數生長期時，對底物的利用速度較快。

圖4 批式發酵試驗結果Fig.4 Results of batch fermentation

2.5 細胞生長動力學模型

在子囊菌屬絲狀真菌(Ascomycotinas sp.)轉化玉米秸稈纖維素的分批發酵過程中發現，高濃度底物對該絲狀真菌產生抑制，因此，不宜采用經典的Monod模型來描述其細胞生長動力學特征。Logistic方程能很好地反映分批發酵過程菌體生長與底物濃度之間的動力學過程，具有廣泛的適用性。Logistic方程為：

式中，Cx為細胞濃度（g·L-1DW），Cxm為最大細胞濃度（g·L-1DW），μm為最大比生長速率（h-1）。以t=0時，Cx=Cx0為初始條件，上式積分后，可得：

將（2）式整理后得：

2.6 產物生成動力學模型

Gaden根據產物生成速率與細胞生長速率之間的關系，將其分為三種類型：生長偶聯模型；混合模型又稱為Luedeking-Piret模型和非生長偶聯模型。從該絲狀真菌分批發酵試驗結果來看，產物CMC-Na酶的生成是伴隨在菌體生長過程中的，可采用生長偶聯模型描述產物酶的生成動力學特征。

生長偶聯模型的數學表達式為：

穩態時，dCx/dt=0，Cx=Cxm

將式（4）積分后得：

式（5）可簡寫為如下形式：

其中，

式(7)中 μm，Cxm，Cx0均已知，以 [CP] 對 A（t）作圖，直線斜率即為α值。

2.7 底物消耗動力學模型

底物消耗主要用于三個方面：細胞生長消耗；細胞維持基本生命活動消耗；合成代謝產物的消耗。因此可用如下動力學方程表示：

式中，CS為基質濃度（mg·L-1），CX為細胞濃度（g·L-1，干重），CP為酶活力單位（U·L-1），m 為細胞的維持系數（s-1），Yx/s為菌體相對于基質的得率系數（g細胞·mg-1基質），其定義為生成細胞的干重與用于細胞生長而消耗基質的質量之比。Yp/s為產物相對于基質的得率系數（U·mg-1基質）。

將式（4）代入式（8）后得：

式(9)可簡化為：

由于維持細胞生長的消耗很小，所以可以忽略不計，即=0

式(10)可簡化為：

將式(11)積分后得：

式(12)簡化為：

式（13）中 γ 可由式（11）得到，μm，Cxm，Cx0均已知，以[Cs0-Cs]對C（t）作圖，直線斜率即為γ值。

2.8 模型求解

將上述各個動力學模型根據試驗數據利用計算機模擬求解，得模型中的各個參數及試驗初始條件如表3所示：

表3 動力學模型參數及初始條件Table 3 Parameters value in the kinetic models and initial conditions of batch fermentation for filamentous fungi

2.9 模型的驗證

在已知試驗條件下，進行絲狀真菌分批轉化玉米秸稈纖維素的重復試驗，分別測定細胞生長，產物酶合成及底物纖維素消耗并繪制曲線，然后對分批發酵試驗的試驗值與動力學模型曲線的模型值進行擬合，得圖5～7。

圖5 細胞生長模型值與試驗值比較Fig.5 Comparison of cell growth model value and test value

圖6 產物酶動力學模型值與試驗值比較Fig.6 Comparison of enzyme activity model value and test value

圖7 纖維素消耗動力學模型值與試驗值比較Fig.7 Comparison of cellulose consumption model value and test value

圖7分別顯示了細胞生長的模型值，產物酶合成的模型值和底物消耗的模型值與試驗實測值擬合程度，其相對誤差分別為0.1998、5.9035和0.00072，相關系數分別為 0.98827、0.98283和0.99599，結果顯示了所建底物消耗動力學模型能夠很好地描述絲狀真菌兼性厭氧液體發酵過程中對基質的消耗規律；而所建立的細胞生長動力學模型和產物合成動力學模型只是基本能較好的反映微生物的實際生長和產酶過程，其模型值與實測值的相對誤差均大于15%。分析可知造成較高相對誤差的區域主要分布在菌體生長的對數期后期，此時由于菌體生長所需的營養開始出現匱乏，造成部分菌體生長速率下降甚至開始出現菌體死亡，因此，所測試驗值與模型值出現較大偏差。此外，由于菌體產酶動力學特征顯示其產酶與菌體生長表現為偶聯型，因此造成產物酶合成的模型值與實測值也表現為較高的相對誤差。再者，造成產物合成動力學模型值與試驗實測值相對誤差較大的另一方面的原因可能是微生物所產纖維素酶系為一復合酶系，其他酶如纖維素外切酶，β-葡萄糖苷酶等的存在可能對CMC-Na酶活大小有一定影響。

3 討論與結論

微生物發酵動力學是生物反應工程學的理論基礎，通過數學模型定量表達發酵過程中各種與微生物生長、基質消耗和產物形成有關的因素，可進一步了解微生物的生理特征，菌體生長和產物形成的合適條件，以及各發酵參數之間的關系，從而為發酵過程的工藝控制，反應器放大以及利用計算機對發酵過程實現自動化控制創造條件。

不同的微生物具有不同的生長代謝特性和代謝規律，通過建立微生物的發酵動力學數學模型可以更好地發揮微生物自身特點以實現更有效的發酵和控制，從而最大限度地獲得理想產物。Logistic方程和Luedeking-Piret方程對于描述微生物生長、基質消耗和產物形成具有廣泛適應性，然而，微生物發酵過程的復雜性以及影響因素的多變性，使得所建發酵動力學模型并不能完全反映實際的微生物發酵過程。為此，在以后的研究過程中需要對實際發酵過程進行多次優化以及對所建模型進行修正和補充，使模型值與試驗數據擬合較好。

本文通過Logistic方程和Luedeking-Piret方程，獲到了產纖維素酶絲狀真菌的兼性厭氧液體發酵動力學模型包括細胞生長動力學模型、底物消耗動力學模型及產物酶合成動力學模型及模型的參數，并對試驗實測值與模型值進行了驗證比較。結果表明，模型計算值與試驗值擬和良好，相關系數分別為：0.98827、0.98283和0.99599，所建模型能較好地描述該絲狀真菌生物降解玉米秸稈產纖維素酶的發酵動力學特征，該研究不同于以往報道中的生產菌株大多為好氧微生物[17-20]，該菌為兼性厭氧微生物，在發酵產酶上具有顯著優勢，研究其兼性厭氧發酵動力學對于進一步優化其產酶條件和提高產酶能力具有一定的參考價值和理論意義。

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