雞痘DNA疫苗pV AX-env的構(gòu)建及其體內(nèi)外表達(dá)

洪 琴，任曉峰，李廣興

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

雞痘是由雞痘病毒（Fowlpox virus,FPV）引起的一種急性接觸性傳染病，各年齡和品種的雞都易感染，但雛雞的敏感性最高[1]。雞痘分為白喉型，皮膚型，和混合型。其特征是在雞的無毛或少毛的皮膚上發(fā)生痘疹，或在雞口腔、咽喉部黏膜形成纖維素性壞死性假膜。雞只患該病后增重緩慢、消瘦，產(chǎn)蛋量暫時(shí)下降[2]。近年來，雞痘鵪鶉化弱毒苗對(duì)雞群進(jìn)行刺種免疫，但常出現(xiàn)免疫失敗，雞群發(fā)生典型雞痘或非典型雞痘的報(bào)道，給養(yǎng)雞戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。目前國內(nèi)外雞痘疫苗研究主要集中于重組雞痘病毒的構(gòu)建，而對(duì)于雞痘病毒DNA疫苗的研究幾乎沒有。雞痘病毒囊膜蛋白由雞痘病毒ORF140編碼，為痘苗病毒H3L編碼的P35蛋白的同系物，在痘病毒屬內(nèi)氨基酸序列高度保守。env蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)成熟病毒結(jié)合到細(xì)胞膜上起重要作用[5]。本試驗(yàn)選取雞痘病毒env基因?yàn)槟康幕?構(gòu)建了含有該基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-env，并進(jìn)行體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和體內(nèi)免疫試驗(yàn)，經(jīng)免疫熒光和RT-PCR檢測證明pVAX-env在體內(nèi)體外都能進(jìn)行表達(dá)，為深入分析env蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞、真核表達(dá)載體

pVAX1、大腸桿菌JM109由本實(shí)驗(yàn)室保存，含有env基因的質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，命名為pMD18-T-env。BHK21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

T4DNA連接酶、exTaqDNA聚合酶、dNTP、DNA限制性內(nèi)切酶PstⅠ和XhoⅠ、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Oligod(T)、Rnase抑制劑、核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等購自TaKaRa公司，Trizol和脂質(zhì)體-2000購自Invitrogen公司，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。兔抗env蛋白多抗血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(第二抗體)購于北京中杉公司。1日齡雛雞購自東農(nóng)孵化場。

1.2 方法

1.2.1 FPV env基因的亞克隆

根據(jù)pMD18-T-env的測序結(jié)果設(shè)計(jì)了兩對(duì)亞克隆引物，ENV-PVAXU：AAAACTGCAGCCGCCA TGGCGCCGGGCGACA；ENV-PVAXL：CCCGCTC GAGTTACATAGAATACGCT。其中上游引物ENVPVAXU含有PstI酶切位點(diǎn)，并在起始密碼子ATG前插入序列CCGCC構(gòu)成Kozak序列。下游引物ENV-PVAXL含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)。理論上可擴(kuò)增993 bp。

以pMD18-T-env質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增按照文獻(xiàn)方法[6-7]采用25 μL體系：

10×PCR 緩沖液（含 2.5 mmol·L-1MgCl2）2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 2.0 μL， 2.5 U exTaq 0.25 μL，25 pmol·L-1的上下游引物各 0.5 μL，模板 0.5 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)至25 μL。

PCR條件為95℃預(yù)變性模板2 min；94℃變性1 min；53.9℃退火30 s；72℃延伸1 min共30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.2.2 重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將上述PCR產(chǎn)物分別用PstⅠ和XhoⅠ雙酶切，并與同樣雙酶切的融合表達(dá)載體pVAX1用T4DNA連接酶在16℃金屬浴中過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落小量制備質(zhì)粒后進(jìn)行菌液PCR和雙酶切初步鑒定。

1.2.3 重組真核質(zhì)粒的體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

將BHK21細(xì)胞接種于24孔板中，在細(xì)胞達(dá)到80%的融合時(shí)開始轉(zhuǎn)染。取2 μg重組質(zhì)粒和2 μL LipofectamineTM2000，分別用100 μL無抗生素、無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋；靜置5 min后將兩者混勻，室溫孵育30 min，以便脂質(zhì)體充分包裹質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，24～48 h后用間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。

1.2.4 間接免疫熒光檢測重組質(zhì)粒體外表達(dá)

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染24 h后取出蓋玻片，按照文獻(xiàn)[7]免疫熒光法檢測目的蛋白表達(dá)：用0.01 mol·L-1預(yù)冷PBS（pH 7.2）清洗3次；用4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min，PBS清洗3次；冷丙酮4℃固定10 min，PBS漂洗。0.1%Triton-X100室溫 5 min，PBS漂洗。然后加入兔抗env多抗血清1∶100稀釋，37℃作用1 h，PBS清洗3次；加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫避光作用45 min，PBS清洗3次；再用中性甘油封片,熒光顯微鏡下觀察表達(dá)情況，以同時(shí)轉(zhuǎn)染PVAX空載體的BHK21細(xì)胞為陰性對(duì)照。

1.2.5 重組真核質(zhì)粒的體內(nèi)試驗(yàn)

堿裂解法大量制備真核表達(dá)質(zhì)粒方法參照文獻(xiàn)[8]。

14日齡商品蛋公雞 (1日齡購自東農(nóng)孵化場)30只分為兩組。各組雞只接種前15 min先在接種部位注射25%的蔗糖溶液100 μL輕柔5 min，第一組胸肌注射 PBS 100 μL只-1，第二組胸肌注射pVAX-env重組真核質(zhì)粒100 ug只-1。注射后24 h，48 h，72 h，7 d，14 d分別采取注射部位的肌肉、皮膚、標(biāo)記好于-80℃保存。

1.2.6 RT-PCR檢測

Trizol法提取組織總RNA按照文獻(xiàn)方法[9]，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL總RNA 10 μL，Oligod(T)2 μL，70 ℃ 10 min 冰上 2 min。RNase Inhibitor 0.5 μL，5×M-MV 緩沖液 4 μL，MMLV 酶 1.5 μL，dNTP（10 mmol·L-1）1 μL，RNase free H2O。42℃水浴1 h,70℃15 min。以cDNA為模板，同1.2.1方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.7 免疫組織化學(xué)檢測重組真核質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)

取出組織，修成適當(dāng)?shù)男K，使用冰凍切片機(jī)把組織切成8～9 μm切片，粘附在APES處理過的載玻片上。室溫干燥1 h，80%丙酮4℃固定過夜，室溫干燥10 min后PBS清洗3次，10%馬血清室溫封閉20 min，一抗：兔抗env多抗血清1∶100稀釋，室溫孵育2 h。PBS清洗3次，孵育1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫避光1 h。PBS清洗3次，再用中性甘油封片，熒光顯微鏡下觀察表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞痘病毒囊膜蛋白的亞克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小一致，約993 bp。將其亞克隆到pVAX1載體上，得到重組質(zhì)粒pVAX-env。通過菌落PCR和重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析得到一個(gè)約993 bp的條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符(見圖1)。

圖1 重組陽性質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Gel electrophoresis on enzyme digestion of pVAX-env

2.2 間接免疫熒光檢測

通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，在熒光顯微鏡下，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pVAX-env質(zhì)粒的BHK21細(xì)胞可以觀察到特異性的綠色熒光信號(hào)主要分布在胞漿（見彩版Ⅰ），而瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PVAX空載體的BHK21細(xì)胞無明顯的熒光信號(hào)（見彩版Ⅱ）。

2.3 RT-PCR檢測pVAX-env的體內(nèi)表達(dá)

提取免疫PVAX-env后和使用注射PBS的雛雞免疫部位肌肉組織的總RNA，使用引物ENVPVAXU和ENV-PVAXL進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，免疫后722 h即可檢測到env的RNA，而PBS組無明顯特異性條帶（見圖2）。

圖2 體內(nèi)表達(dá)試驗(yàn)RT-PCR結(jié)果Fig.2 RT-PCR identification of env mRNA in vivo expression experiment

2.4 組織免疫熒光檢測pVAX-env的體內(nèi)表達(dá)

取72 h pVAX-env組和PBS組帶皮的肌肉組織制作冰凍切片，間接免疫熒光檢測pVAX-env體內(nèi)表達(dá)情況。pVAX-env組肌肉組織在肌膜、肌束膜（見彩版Ⅲ）和肌纖維間隙浸潤的淋巴細(xì)胞胞漿內(nèi)可見特異性的熒光（見彩版Ⅲ箭頭）。而PBS對(duì)照組無明顯熒光（見彩版Ⅳ）。

3 討論與結(jié)論

近年來，在已免疫的雞群中常有雞痘的爆發(fā)。說明現(xiàn)用的雞痘鵪鶉化弱毒苗不能提供針對(duì)雞痘病毒的有效地保護(hù)。其爆發(fā)的原因包括新抗原變異株的出現(xiàn)；活疫苗弱毒株由于反復(fù)接種傳代，可能出現(xiàn)毒力返祖，造成毒力增強(qiáng)而爆發(fā)雞痘；還有一些報(bào)道雞痘疫苗有REV污染引起REV相關(guān)疾病；在美國和澳大利亞的研究表明雞痘分離株和疫苗株中整合有完整的REV前病毒[10]。整合有完整的REV前病毒的FPV可能加強(qiáng)感染雛雞致病性。更有報(bào)道認(rèn)為REV前病毒的整合早在50年前就已經(jīng)發(fā)生了[4]。我國的研究也發(fā)現(xiàn)分離的野毒株中含有REV的前病毒基因序列,國產(chǎn)疫苗當(dāng)中也整合有REV的LTR序列[11-12]。甚至重組雞痘病毒疫苗也整合有REV前病毒序列。而且不同病原的重組雞痘病毒 (rFPV)在

雞群進(jìn)行間隔性的多次免疫時(shí)，后期免疫會(huì)受到前期免疫所誘生的載體特異性免疫反應(yīng)的干擾，并導(dǎo)致其免疫效力下降[13]。對(duì)于雛雞體內(nèi)的母源抗體對(duì)于雞痘鵪鶉化弱毒苗和重組雞痘病毒疫苗免疫有一定的影響[14]。DNA疫苗是一種新型的基因工程疫苗，它將含有編碼某種抗原蛋白基因序列的重組質(zhì)粒作為疫苗直接導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞內(nèi)，通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，從而使被接種機(jī)體獲得相應(yīng)的免疫保護(hù)而達(dá)到防病治病的目的。其安全有效，使用簡便，可長期在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)而使機(jī)體獲得持續(xù)性的免疫力且不受母源抗體的影響等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到人們的重視，被看作是繼傳統(tǒng)疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第3代疫苗[15]。雞痘病毒FPV140編碼病毒的囊膜蛋白沒有保守的糖基化位點(diǎn)。一個(gè)短的N端疏水序列和一個(gè)長的C端疏水區(qū)在所有同系物中都保守。N端不是信號(hào)肽序列所以不能轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，C端疏水區(qū)預(yù)測為跨膜區(qū)。這個(gè)疏水區(qū)是它到IMV膜入點(diǎn)。FPV140蛋白和VACV H3L蛋白一樣，有豐富的堿性殘基和包含潛在的硫酸乙酰肝素結(jié)合位點(diǎn)。這說明FPV140蛋白，像他的VACV同系物，能夠有功能使IMV結(jié)合到細(xì)胞膜[4]。本試驗(yàn)構(gòu)建了雞痘DNA疫苗pVAX-env真核表達(dá)質(zhì)粒，并成功的證明其在體內(nèi)外都能獲得表達(dá)，為進(jìn)一步進(jìn)行雞痘病毒核酸疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

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