熱休克對小鼠胚胎成纖維細胞CaMm RN A和H SF活性的影響

李金波，張 霞，田文儒，曹榮峰，高善頌，張桂林

（青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109）

熱休克反應的研究已經深入到細胞和分子水平，其中包括胞外信號通過細胞膜、細胞質進入細胞核的轉導過程。生物體如何感受和傳導熱休克信號，以激活熱休克基因的表達和誘導耐熱性的機制是目前人們研究的熱點問題。鈣調蛋白（Calmodulin，CaM）作為細胞中Ca2+最重要的多功能受體蛋白，是細胞信號轉導途徑中的主要信號分子，在生物的生長發育及基因表達調控中發揮重要功能[1]。Ca2+和CaM在熱休克反應中的作用也有一些報道，如熱休克引起胞內Ca2+濃度快速上升[2－5]、Ca2+促進熱休克蛋白的合成[6－7]。熱休克反應的調控機制非常復雜，熱休克基因的轉錄需要熱休克轉錄因子（HSF）介導，HSF活性的調節是熱休克基因轉錄調節的中心機制。為此，本文用體外培養的小鼠胚胎成纖維細胞，經不同梯度熱休克處理，觀察熱休克對CaM mRNA和HSF活性的影響，旨在闡明CaM與HSF的關系，為從分子水平深入研究熱休克蛋白的調控機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

昆明小白鼠（8～9周齡）購自山東大學實驗動物中心；DMEM培養基（購自Gibco公司）；胎牛血清（FBS）（購自杭州四季青公司）；RNA提取試劑盒（購自原平皓生物有限公司）；反轉錄試劑盒（購自MBI Fermentas）；rTaq DNA聚合酶和DL2000 Marker（購自大連TaKaRa公司）；核蛋白抽提試劑盒（購自碧云天）、非放射性EMSA試劑盒（購自寧波唯奧）。 Steri－Cycle CO2Incubator（HEPA CLASS 100，USA）；超凈工作臺 SW－CJ－IFD（蘇凈集團安泰公司，中國）；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，日本）；垂直電泳儀與蛋白轉印裝置（Bio－Rad）。

1.2 小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）培養

斷頸處死妊娠12 d的小鼠，剖腹取胎鼠，去除胎鼠頭、四肢和內臟，將軀干剪成1 mm3的小塊，加入0.25%胰酶，37℃消化5 min，終止消化后，吹打混勻靜置5 min，吸取上層液并以1 000 r·min－1離心6 min，充分吹打重懸細胞，接種于培養板中，置于37℃，5%CO2細胞培養箱中常規培養。

1.3 MEF的熱休克處理

待細胞培養至90%融合時，用0.25%的胰酶消化，臺盼藍染色計數，以1×106個·mL－1的細胞密度接種于60 mm細胞培養皿中，進行試驗分組。試驗分為四組：一個常溫對照組（37℃）和3個熱休克組（38℃1 h，40℃1 h，42℃1 h），熱休克處理后分別提取總RNA和核蛋白進行后續檢測。

1.4 CaM mRNA的半定量檢測

根據GenBank中收錄號為BC054805的小鼠CaM1基因序列設計引物，送上海生工生物工程技術服務有限公司合成引物。序列如下：PF：5′GAATGGTTACATCAGTGCGG 3′；PF：5′TCGCCA TCAATATCTGCTTC 3′，擴增片段長度為111 bp。按照EASYspin組織/細胞RNA快速提取試劑盒（原平皓）說明，提取各孔細胞總RNA。根據RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）說明，進行RT反應，PCR條件：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共進行30個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5 g·L－1溴化乙啶），由GDS－8000凝膠成像分析系統拍照鑒定。用Glyko BandScan5.0對試驗結果進行灰度掃描。

1.5 凝膠遷移阻滯分析

按照碧云天核蛋白抽提試劑盒抽提細胞核蛋白。凝膠遷移阻滯分析參照非放射性EMSA試劑盒說明書進行，即10 μL全細胞提取液 (含50 μg蛋白)，1 ng生物素標記的HSF，在20 μL結合緩沖液（20 mmol·L－1Tris－HCl，pH 8.0，50 mmol·L－1NaCl，15 mmol·L－1MgCl2，0.5 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1DTT，10%glycerol），20℃保溫15 min，混合物在5%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中分離，電極緩沖液為0.25×TBE，200 V穩壓，常溫下電泳3～4 h，轉膜，交聯固定DNA，化學發光法檢測HSF與DNA的結合活性。

2 結果與分析

2.1 熱休克對CaM mRNA表達的影響

采用PF和PR引物擴增反轉錄產物，產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析后，擴增片段長度在100 bp附近，與預期片段長度111 bp相一致，擴增成功（見圖1）。半定量RT－PCR檢測不同溫度條件下CaM mRNA表達的結果為，38℃處理組細胞的CaM mRNA表達顯著高于37℃組（P＜0.05）；40和42℃處理組細胞的CaM mRNA表達極顯著高于37℃組（P＜0.01），但與40℃處理組細胞相比，42℃處理組細胞的CaM mRNA表達略有下降（見圖2、表1）。

圖1 CaM基因PCR擴增結果Fig.1 PCR of the CaM genes

圖2 不同溫度梯度熱休克組細胞的CaM mRNA表達Fig.2 Expression of CaM mRNA in different group treated by heat shock

表1 不同溫度熱休克處理對小鼠胚胎成纖維細胞中CaM mRNA表達的相對值Table 1 Relative values of CaM mRNA expression in different temperature treated MEF(n=3，±S)

表1 不同溫度熱休克處理對小鼠胚胎成纖維細胞中CaM mRNA表達的相對值Table 1 Relative values of CaM mRNA expression in different temperature treated MEF(n=3，±S)

注：與對照組相比，*為差異顯著（P＜0.05），**為差異極顯著（P＜0.01）。下表同。Note:Compared with control group,*denote significant difference(P＜0.05),**denote extremely significant difference(P＜0.01).The same as below.

組別Groups CaM mRNA expression(mRNA/18SrRNA)對照組Control group 0.49±0.13 38℃組Group 38℃ 0.54±0.15*40℃組Group 40℃ 0.93±0.14**42℃組Group 42℃ 0.71±0.08**

2.2 熱休克對HSF與DNA結合活性的影響

小鼠胚胎成纖維細胞經不同溫度熱休克處理后，抽提細胞核蛋白，使用凝膠遷移阻滯方法對HSF與DNA結合活性進行檢測，結果見圖3。用Glyko BandScan5.0對目的條帶進行灰度掃描（見表2），HSF與探針復合物隨溫度的升高而明顯增多并上移，且具有溫度依賴性。

表2 不同溫度熱休克處理組細胞HSF與DNA結合活性變化Table 2 Binding activity of HSF and DNA in different temperature treated groups(n=3，±S)

表2 不同溫度熱休克處理組細胞HSF與DNA結合活性變化Table 2 Binding activity of HSF and DNA in different temperature treated groups(n=3，±S)

組別 Groups 灰度值（grey）空白組Blank group 0對照組Control group 40.20±0.80 38℃組Group 38℃ 69.79±2.61**40℃組Group 40℃ 99.60±7.94**42℃組Group 42℃ 112.50±8.78**

圖3 不同溫度梯度熱休克處理細胞的HSF活性表達Fig.3 The HSF activity in different group treated by heat shock

3 討論與結論

細胞信號轉導最重要的特征之一是它是一個網絡系統。在熱休克蛋白表達之前，許多信號分子發生了轉變，如pH，IP3，DG，cAMP，Ca2+和CaM等[2]。CaM是分布最廣泛的Ca2+受體，Ca2+/CaM復合物是一種參與多種信號傳遞途徑的信號分子，調控胞內許多生理過程。研究熱休克對植物細胞影響時發現，熱休克能引起玉米細胞內CaM濃度升高[8]和誘導擬南芥細胞中與CaM相關的TCH基因的表達[9]。熱休克反應的調控是相當復雜的。熱休克基因的轉錄需要HSF介導，HSF活性的調節是熱休克基因轉錄調節的中心機制。鈣調素對HSF活性調節也可能存在多條途徑。前人的一些研究表明，HSF的活性也受熱激蛋白(如Hsp70，Hsp90)自身的反饋調節，Hsp70等復合體能與HSF結合而抑制HSF的活性，植物方面也有關于Hsp70負調節作用的證據。我們用免疫共沉淀和酵母雙雜交的方法也證明細胞內Hsp70與HSF的結合。此外通過體外結合、酶活性的競爭抑制試驗和免疫共沉淀也證明細胞質Hsp70能與CaM結合。因此有可能存在另外一條CaM調節熱激基因表達的信號轉導支路，即熱激時CaM通過與Hsp70的結合，解除Hsp70對HSF的抑制作用，從而促進熱激基因的表達。但目前還缺乏CaM，HSF以及Hsp70等蛋白之間的相互作用的進一步證據。根據前述的試驗結果，試驗提出在動物細胞內存在一條新的熱激信號轉導途徑-鈣-鈣調素途徑：熱刺激首先被一種未知的膜上受體所感受，傳遞到膜上的鈣通道，引起鈣通道打開，使胞內Ca2+濃度升高; 在動物中感受高溫的受體和鈣離子的通道有待于深入的研究。引起Ca2+升高的另一條途徑是熱刺激被膜上受體感受后，激活膜上的PLC活性，使胞內IP3水平提高，IP3激活液泡膜等胞內鈣庫膜上的鈣離子通道，釋放鈣離子，引起Ca2+升高，Ca2+激活CaM促進CaM基因的表達，活化的Ca2+/CaM通過激活鈣調素結合的蛋白激酶或蛋白磷酸酶調節HSF的磷酸化，由此促進HSF與HSE的結合，進而激活熱激蛋白基因的表達，最終引起動物耐熱性的改變[15]。有人推測，在正常情況下，細胞中HSF以單體的形式與HSP70結合，而熱休克時，CaM可能與HSP70結合，從而釋放HSF并使之形成三聚體，次三聚體進入細胞核與熱休克蛋白結合位點，即熱休克元件（HSE）結合，從而解除HSP70對HSF的抑制作用，并啟動熱休克蛋白基因的轉錄[10]。

本研究通過采用半定量PCR方法和凝膠遷移阻滯（EMSA）對CaM mRNA和HSF活性進行檢測，結果顯示不同梯度的熱休克均可明顯增加CaM mRNA的表達量，在40℃以內，呈溫度依賴關系；但與40℃相比，42℃處理組CaM mRNA表達反而略有下降，這可能與Ca2+對CaM負反饋調節有關。不同溫度梯度的熱休克可明顯增強HSF的活性，這表明熱休克后HSP70合成調控的途徑之一是，首先增強HSF與DNA的結合活性，從而促進HSP70 mRNA的表達，但Ca2+/CaM信號通路對HSF調控HSP70表達的詳細機制有待于進一步研究。

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