豬GSTM2基因的多態性及與生產性狀相關性分析

王嘉博，祝繼原，俄廣鑫，楊少成，劉 娣*

（1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農業科學院，哈爾濱 150086）

谷胱甘肽硫轉移酶 (Glutathione S-transferases；簡稱GSTs)是生物體內一種重要的一相解毒酶，GST mu2基因屬于GSTs的mu亞型，mu亞型在消除自由基、過氧化物、親電子基團和中間數具有酶功能，并參與細胞保護和調節細胞生長，GSTM2具有前列腺素E合成酶(PGES)的活性，可以參與前列腺素E2(PGE2)的合成[1]。有研究表明GSTM2在卵巢中表達，其意義可能在于保護卵子免受有毒物質的傷害和產生PGE2[2]。研究發現，僅在妊娠第3、4天的小鼠宮腔上皮中檢測到GSTM2的表達。小鼠胚胎著床發生在妊娠第4天的子夜，妊娠第3、4天是子宮為胚胎著床的準備期，此時孕酮的含量也大量增加，在這一階段，GSTM2高表達于腔上皮，推測該分子可能與胚胎著床時的子宮分化為接受態有關，并且可能受體內的孕酮調節。GSTM2所起作用以及作用機理有待于進一步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PCR-SSCP用組織樣：法系大白豬（50頭）和大民豬（大白豬♂×民豬♀，100頭）兩個品種共150個母豬耳組織樣，均采自黑龍江省農科院畜牧研究所。

1.2 引物設計及反應條件

根據GenBank上發表的豬GSTM2基因序列（No.DQ988118）和鼠的 GSTM2基因序列（No.BC037068），在第2、第5和第7外顯子處設計3對引物（見表1）。

表1 豬GSTM2基因PCR-SSCP分析用引物Table 1 Primers for PCR-SSCP analysis on pig GSTM2 gene

1.3 擴增產物的PCR-SSCP

取2 μL PCR產物置于PCR管中加8 μL變性Buffer，混勻，98℃變性10 min，迅速插入冰中，使之保持變性狀態。18%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。高壓250 V預電泳5 min，然后5 V·cm-1，電泳14～16 h后，銀染顯色[3]。

1.4 統計分析

計算各基因型的頻率和PIC（群體雜合度）值，將基因型與各個性狀指標進行最小二乘分析（JMP7.0）。

用于分析的統計模型為：Y=μ+G+e其中，Y為性狀的表型值，μ為群體均值，G為基因型固定效應，e為剩余效應。

采用x2檢驗對試驗結果進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 SSCP檢驗結果

3對引物經PCR擴增后獲得各自長度的特異帶，電泳結果見圖1。PCR-SSCP結果見圖2～4。

從圖2可以看到G2位點的多態分析結果，一共6種帶型，3個等位基因A、B和C。圖3中G5位點的多態分析結果：3種帶型，2個等位基因。圖4中G7位點的多態分析結果：3種帶型，2個等位基因。

圖1 對引物PCR-SSCP擴增產物Fig.1 PCR-SSCP amplification products of three pairs primers

圖2 G2引物PCR-SSCP檢驗結果Fig.2 PCR-SSCP test results of G2 primers

2.2 各基因型在2個豬種中的分布

對法系大白豬和大民豬共150個樣品進行PCR-SSCP檢驗，得到各基因型在這兩個豬種中的分布情況。從表2可見G2位點為高度多態位點，并且G2位點法系大白豬與大民豬的等位基因頻率存在顯著差異。其他兩個位點屬于中度多態位點，只有三種帶型，兩個等位基因。

2.3 各基因型與生產性狀相關性分析

圖3 G5引物PCR-SSCP檢驗結果Fig.3 PCR-SSCP test results of G5 primer

圖4 G7引物PCR-SSCP檢驗結果Fig.4 PCR-SSCP test results of G7 primer

通過對150頭母豬的生產性狀記錄、對比，將結果與基因型聯系、分析。結果見表3～5。最后計算各個基因型之間生產性狀的分布差異檢驗的P值。由此可見，G2、G5、G7位點對母豬總產仔數和活產仔數影響板顯著（P＜0.01），這三個位點中都是AB基因型個體的總產仔數平均數最高，進一步驗證了雜合基因型高于純合基因型性狀的理論。這個位點對斷奶窩平均重影響不顯著。G2位點對窩平均初生重影響顯著。由表3～5可見AB型在總產仔數、活產仔數上最高且與其他基因型差異極顯著。AA與BB性狀表現基本一致，也進一步說明了雜合基因型優于純合基因型。

表2 不同品種豬GSTM2基因的基因型頻率和基因頻率Table 2 Allele ferquencies and genotype frequencies of GSTM2 among two breeds

表3 母豬G2多態位點的各生產性狀Table 3 G2 polymorphic loci in various production traits

表4 母豬G5多態位點的各生產性狀Table 4 G5 polymorphic loci in various production traits

表5 母豬G7多態位點的各生產性狀Table 5 G7 polymorphic loci in various production traits

3 討論與結論

Booth J和Canbes B等先后在肝臟細胞抽提液中發現了能夠催化GSH偶聯到1，2-二氯-4-硝基苯的活性酶，從而開啟了近40年來對谷胱甘肽硫轉移酶進行比較生物化學和酶學研究的先河[4-5]。GST mu2基因是一段屬于mu亞型，mu亞型在消除自由基、過氧化物、親電子基團和中間數具有酶功能，并參與細胞保護和調節細胞生長，在人類基因組中mu亞基是在染色體的1p13.3（1號染色體短臂上的一個位置）上編碼蛋白[6]。

通過參考GenBank上的GSTM2基因序列，克隆得到豬GSTM2基因序列，通過對比發現了三個多態位點，針對這三個多態位點進行了SSCP-PCR檢測。G2位點，該片段中在內含子2的370 bp處以及外顯子2的399 bp處存在2個核苷酸多態，其中，外顯子內的多態沒有導致編碼蛋白改變，屬于同義突變。G5位點，該片段中在外顯子5的1 435 bp處存在核苷酸多態。該處突變導致終止密碼子提前，終止翻譯。G7位點，該片段中在外顯子7的2 466、2 486 bp以及內含子2 395和2 406 bp處存在4個核苷酸多態，沒有發現和網上序列一致的基因型，并通過大量測序及基因型觀察，這4個核苷酸突變是基因連鎖，CACA/ATTG。其中外顯子突變導致蛋白質多肽鏈氨基酸的改變，分別是F/S、E/V。

經過SSCP檢測，150個母豬中G2位點上法系大白豬B等位基因占優勢，但大民豬中A等位基因占優勢，G5位點上2豬種均是B等位基因占優勢，G7位點上2豬種均是B等位基因占優勢。各基因型與生產性狀相關性分析表明，基因中G2、G5、G7各位點的AB型總產仔數都為最高，可進一步說明這三個位點的突變對母豬生產性狀影響極顯著。

因此，本研究認為GSTM2基因的PCR-SSCP可以作為與豬產仔數相關的遺傳標記，研究GSTM2基因的多態性可以探討GSTM2基因對于豬繁殖性狀的重要意義。

[1] Janeric,Ronald W P.A glutathione transferase in human leukocytes as a marker for thesusceptibility to lung cancer[J].Carcinogenesis，1986,7(5):751-753.

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[3] 李洪敏,吳雪瓊,張俊仙,等.應用PCR-SSCP快速鑒定結核分枝桿菌復合群[J].微生物學通報,2000,27(3):202～204.

[4] 楊海靈.聶力嘉,朱圣庚,等.谷胱甘肽硫轉移酶結構與功能研究進展[J].成都大學學報,2006，3(1):19～24.

[5] 王智慧,吳逸明,吳擁軍.人谷胱甘肽硫轉移酶Pi基因的克隆及表達[J].醫藥論壇雜志.2004，25(11):6～8.

[6] Huang Jingshu,Xiong Yuanzhu.Cloning,sequence analysis and identification of a nonsense mutation-mediated mRNA decay of porcineGSTM2gene[J].ActaBiochimicaetBiophysicaSinica,2007,39(8):560-566.