鴨副粘病毒與H9亞型禽流感病毒雙重PCR檢測方法的初步建立

劉宇卓，魏雪濤，李 銀，張敬峰

（1.江蘇省農業科學院獸醫研究所，南京 210014；2.農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，南京 210014；3.國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014）

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）所引起的禽類疾病[1]，是一種嚴重威脅全世界養禽業的重要疾病。1994年我國學者陳伯倫從發病蛋雞分離到H9N2亞型AIV。此后，H9N2亞型AIV在我國被廣泛報道，多呈低致病性感染，并呈逐漸蔓延之勢。鴨、鵝等水禽一直被認為是AIV巨大的基因儲存庫，其充當著流感病毒由野生水禽到陸生禽類傳播過程中間媒介的作用。但近年來，H9N2亞型禽流感對水禽感染毒性增強[2-4]。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種嚴重危害養禽業的重要傳染病病原之一，該病毒為禽副粘病毒科副粘病毒屬病毒，給全球養禽業造成嚴重經濟損失。過去一般認為水禽（如鵝、鴨等）對NDV的易感性較差，多呈隱性感染。而自20世紀90年代以來，國內外愈來愈多的報道顯示NDV對水禽的致病力逐漸增強，鵝、鴨等水禽已成為易感禽類[5-7]。鴨的副粘病毒病和鴨的H9亞型禽流感感染在臨床表現及剖檢癥狀上有很多相似的地方，給臨床診斷帶來很多困擾，嚴重影響疫病的診治和預防，因此，本文探索對這兩種病原進行雙重PCR檢測，一次性對兩種病原進行檢測，縮短臨床診斷時間，提高敏感性及特異性，同時亦可用于鑒別診斷。

1 材料與方法

1.1 病毒

雞源H9亞型禽流感病毒（AIV H9）、鴨副粘病毒（DPV）、雞新城疫病毒（NDV）、鴨源H9亞型禽流感病毒（AIV H9）、雛鴨病毒性肝炎病毒（DHV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBVP）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）均為江蘇省農科院獸醫研究所家禽重大疫病防控項目組保存。

1.2 試劑

PCR試劑盒、pMD18-T載體、常用工具酶以及凝膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司；LB培養基、Trizol抽提試劑、焦碳酸二乙酯（DEPC）購自Invotrizen公司；氨芐青霉素為Promaga公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.3 引物的設計與合成

根據GenBank已發表的兩種病毒基因序列，選擇核苷酸保守序列，利用primer6.0分析軟件，設計了2對特異性引物，由TaKaRa公司合成。

1.4 雙重RT-PCR檢測方法的建立

1.4.1 RNA的提取

取已知H9亞型AIV和DPV兩種病毒混合尿囊液，同時分別以兩種病毒作為陽性對照，10 000 r·min-1離心30 min，取上清液每管依次加入Trizol 800 μL，振蕩混勻，室溫放置10 min，加入氯仿200 μL，劇烈振蕩后，室溫放置1 min，4℃12 000 r·min-1，離心 15 min，取上層水相 750 μL，加入500 μL異丙醇，混勻，-20℃放置15 min，4℃10 000 r·min-1離心1 min，去上清，緩緩加入75%乙醇1 mL洗滌，4℃ 8 000 r·min-1離心5 min，去上清，室溫干燥20 min，加入DEPC水10 μL，使充分溶解。

1.4.2 雙重RT-PCR

1.4.2.1 反轉錄 （RT）

5×AMV Buffer 4 μL、10 mmol·L-1dNTPs 2 μL、兩對反轉錄引物各1 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、RNA 模 板 10 μL，AMV 反 轉 錄 酶 0.5 μL，H2O（DEPC 處理）1 μL，總體積為 20 μL，瞬間離心混勻，65℃反應15 min，42℃孵育1 h，95℃5 min，同時設立陰性、陽性對照，產物置-20℃保存備用。

1.4.2.2 PCR

按25 μL體系進行。在PCR反應管中分別加入：含 MgCl2（25 mmol·L-1）1.5 μL，滅菌水 14 μL，反轉錄產物 4 μL，10×EX TaqDNA聚合酶buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL，兩種上、下游引物 50 pmol·μL-1各 0.5 μL，EX TaqDNA 聚合酶0.5 μL。94℃ 3 min，然后進入循環 94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環，于72℃延伸10 min，4℃保存。將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120 V，時間30 min，紫外燈下觀察結果，并進行拍照。

1.4.3 PCR產物序列測定和分析

切割回收目的片段，然后按凝膠回收試劑盒說明書所示方法純化回收PCR產物。按pMD18-TVector說明加入連接體系，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑選單菌落，用堿裂解法抽提質粒DNA進行PCR鑒定，陽性克隆菌由南京基天生物技術公司進行測序，并對基因序列用DNAstar軟件對測序結果進行拼接和分析。

1.5 雙重RT-PCR特異性試驗

取RNA病毒DHV、IBV、IBDV尿囊液，同時取H9亞型AIV、DPV及其混合物作為陽性對照，滅菌水作為空白對照，按上述方法提取RNA，用兩對特異性引物進行雙重RT-PCR，對PCR產物進行電泳觀察結果。

1.6 雙重RT-PCR敏感性試驗

取含H9亞型AIV及含DPV的尿囊液，分別測定病毒液的雞紅細胞凝集價（HA），以相同的HA價為基礎，分別10倍倍比稀釋，取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，并測定對應濃度下 RNA 含量，將相同的稀釋度混合為一個樣品，提取RNA，并用建立的雙重RT-PCR方法對上述各定量樣品進行測定，比較檢測血凝效價為0的樣品及最低稀釋度毒液的RNA濃度，研究雙重RT-PCR方法的敏感性，同時與HA方法進行比較。

1.7 雙重RT-PCR穩定性研究及應用

1.7.1 待檢樣品

取-20℃保存不同時間NDV及H9亞型禽流感病毒尿囊液；取病死或攻毒后死亡鴨，采集鴨肺臟、脾臟、肝臟等組織；用棉拭子采集攻毒后存活鴨喉頭分泌物，置30%甘油生理鹽水中，-20℃保存備用。

1.7.2 待檢樣品處理

取-20℃保存2、4和12個月的ND及H9亞型禽流感病毒尿囊液，凍融2次；取待檢病料置無菌研缽中剪碎并研磨，按1∶3加入滅菌生理鹽水，將保存的喉拭子充分捻動、擠干后棄去拭子。均4℃ 12 000 r·min-1，離心10 min，取上清。

1.7.3 雙重RT-PCR

取上述待檢材料，分別提取RNA，并按已建立的方法進行雙重RT-PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 雙重RT-PCR的建立

2.1.1 雙重RT-PCR的反應條件優化

按方法中條件進行RT-PCR。將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120 V，時間30 min，紫外燈下觀察結果，并進行拍照。試驗結果如圖1所示。由PCR產物的電泳圖可知，一次性擴增出兩條目的條帶：大小為732 bp的H9亞型AIV，大小為363 bp的DPV，均與預期目的條帶相符。

2.1.2 目的片段的克隆和測序

切取目的片段進行膠回收，克隆、轉化后進行陽性質粒篩選、測序。測序結果與GenBank上公布的兩種病毒的序列進行比較，同源性達96%～99%。

2.2 雙重RT-PCR特異性試驗

RT-PCR產物電泳結果見圖2。由圖2可知：用已建立的雙重RT-PCR方法，不但AIV H9與DPV混合液出現兩條特異性條帶，AIV H9與DPV均在相對應位置出現特異性條帶，而其他病毒及空白對照均未出現條帶，表明該方法具有特異性。

圖1 雙重RT-PCR方法的建立Fig.1 Duplex RT-PCR amplification of two virus gene

圖2 雙重RT-PCR特異性試驗Fig.2 Specificity test of duplex RT-PCR products

2.3 雙重RT-PCR敏感性試驗

取H9亞型AIV、DPV，以相同的血凝價為基礎，10倍倍比稀釋至10-7，分別提取RNA，并檢測血凝效價為0的樣品的RNA濃度，分別進行RT-PCR。試驗結果顯示，稀釋到10-4的病毒液的HA效價為0，而用RT-PCR方法，無論其中一種病毒檢測還是混合病毒檢測均可以檢出稀釋到10-5的病毒液（見圖3）。說明該方法敏感性高于常規的HA檢測方法100倍以上。經測定10-5病毒液的RNA濃度為2 ng·μL-1，因此該方法可檢測的最小病毒核酸量為 2 ng·μL-1。

圖3 雙重RT-PCR敏感性試驗Fig.3 Sensitivity test of duplex RT-PCR products

2.4 雙重RT-PCR的穩定性及應用

取-20℃保存2、4和12個月的陽性NDV、DPV及不同H9亞型AIV尿囊液，提取RNA并進行雙重RT-PCR，均能擴增出特異性條帶。

對臨床疑似病例及攻毒死亡禽組織進行雙重RT-PCR方法檢測，同時采用雞胚分離方法進行對比，陽性符合率達100%。

3 討論與結論

1966年Hommee和Esterday第一次在美國威斯康辛的火雞中分離到H9亞型禽流感病毒[8-9]，此后該亞型病毒不斷的在雞群尤其是火雞群中流行。進入90年代，H9亞型禽流感病毒呈廣泛流行趨勢，危害日趨嚴重。1995～1999年，在德國及意大利、愛爾蘭、南非、美國、韓國等多個國家的多種禽類中均有發生[10]。1994年國內由陳伯倫等首次分離到H9N2亞型禽流感病毒[11]。之后的幾年里，H9N2亞型禽流感在我國家禽中廣泛流行，危害日趨嚴重。據統計，1996～2000年間，我國H9N2型禽流感占感染雞群的93.89%，成為影響養禽業的主要病害。

H9N2亞型禽流感病毒還可感染人，具有重要的公共衛生意義。1999年，Peiris等在香港分離到了人源H9N2亞型流感分離株（A/HK/1073/99）[12]，同年郭元吉等人對深圳人群作流感的血清學監測，從19%的人體中分離到H9N2亞型流感病毒[13]。因此，開展針對H9亞型禽流感病毒的快速診斷及相關研究顯得尤為重要。

PCR是一種高度特異、靈敏的方法，在疾病的診斷上有著較為廣泛的應用。因所設計合成的引物具有針對性，其反應具有特異性、敏感性、穩定性的特點，檢測效率遠遠高于實驗室傳統的一些常規檢測方法。隨著PCR實驗室技術的日益成熟而越來越受到歡迎，已被廣泛地應用于檢測、診斷和流行病學調查等方面。本檢測方法的建立是基于DPV及H9亞型AIV兩種病毒的RT-PCR檢測方法[6,14]，利用一次PCR，對兩種流行病混合感染進行診斷，也可以用于檢測其中的某一種病毒。本研究所建立的雙重RT-PCR方法，由試驗結果可知其敏感性良好，對兩種病毒的最低檢測含量均為2 ng·μL-1，是血凝試驗的100倍。同時該方法具有較強的特異性，可以特異性地檢測出DPV、H9亞型AIV或同時檢出此兩種病毒，卻不能檢出DHV、IBDV、IBV等。

本試驗從含毒尿囊液、發病死亡禽組織臟器中提取總RNA，進行雙重RT-PCR檢測，與用雞胚分離病毒結果相符，而采集攻毒后喉拭子進行PCR檢測與雞胚分離比較結果卻不理想，較雞胚分離陽性結果相去甚遠。分析原因，可能是拭子中病毒的含量極低，用雞胚分離，通過數天的增殖可逐漸地達到一定的病毒量，而PCR方法需要一定的起始病毒量作為模板。因此，條件允許的情況下，可以采用雙重RT-PCR方法檢測經雞胚分離培養的尿囊液及發病死亡家禽的組織臟器的病毒核酸，從而進行診斷。由于鴨副粘病毒及H9亞型禽流感病毒均具有血凝特性，因此采用該方法不僅操作簡便、特異性強，而且對鑒別診斷具有極高的應用價值。

[1] 于康震,崔尚金,付朝陽,等.禽流感與養禽業發展和人類健康[J].中國預防獸醫學報,2000,22(4):73-76.

[2] 劉秀梵.家養水禽在我國高致病性性禽流感流行中的作用[J].中國家禽,2004,26(12):4-8.

[3] 傅光華,程龍飛,施少華,等.產蛋異常蛋鴨H9N2亞型禽流感病毒的分離鑒定[J].中國農學通報,2009,25(22):21-24.

[4] 萬春和,傅光華,程龍飛,等.禽流感病毒全基因測序及遺傳進化分析[J].農業生物技術學報,2009,17(5):750-757.

[5] 黃瑜,李文楊,程龍飛,等.番鴨副黏病毒1型的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報,2005,27(2):148-150.

[6] 崔華敏,陳立功,董兵,等.鴨源新城疫病毒分離株的生物學特性鑒定[J].中國家禽,2007,29(21):24-26.

[7] 李建俠,刁有祥,劉霞,等.鴨副粘病毒病RT-PCR診斷方法的建立與應用[J].西北農林科技大學學報:自然科學版,2010,38(11)：31-35.

[8] Homme P J.B C Easterday Avian influenza virus infectious.I.charaterization of influenza a/Turkey/Wisconsin/1966 virus[J].Avian Disease,1970,14:66-74.

[9] Nobusawa,E,Aoyama,et al.Comparison of complete amino acid sequences and receptor-binding[J].Virology,1991,182(2):475-485.

[10] Alexander D J.A review of avian influenza in different bird species[J].Veterinary Microbiology,2000,74(1-2):3-13.

[11] 陳伯倫,張澤紀,陳偉斌.禽流感研究I.雞A型禽流感病毒的分離與血清學初步鑒定[J].國獸醫雜志,1994,20(10)：3-5.

[12] Peiris M,Yuen K Y,Leung C W,et al.Human infection with influenza H9N2[J].Lancet,1999,354:916-917.

[13] 郭元吉,李建國,程小雯,等.禽H9N2亞型流感病毒能感染人的發現[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,1999,13(2)：5-8.

[14] 齊巖,袁潤余,張賀楠,等.H9N2亞型禽流感病毒廣東分離株的全基因克隆及序列分析[J].病毒學報,2010,26(3):176-182.